Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 64
Текст из файла (страница 64)
Как правило, если связываниеполивалентного антигена происходит в двухучастках связывания антигена, то сродствоРис. 33.10. Иммуноглобулин G имеетY-образную форму. Наличиев молекуле шарнирного соединения обусловливает подвижность отдельных участков.33. Иммуноглобулины23933.8. Антитела образуются под действиемотбора или инструкции?Специфичность ферментов вырабатываласьна протяжении миллионов лет эволюции.Специфические антитела появляются в крови животного всего лишь через нескольконедель после воздействия чужеродной детерминанты. Каким же образом обеспечивается образование специфических антителв столь короткое время?1.
В 1940 г. Лайнус Полинг (Linus Pauling)предложил так называемую инструктивнуютеорию, согласно которой антиген действует как матрица, определяющая конформацию новообразованной полипептидной цепи антитела. При этом предполагалось, чтомолекулы антител с данной последовательностью аминокислот обладают потенциальной способностью к образованию антигенсвязывающих участков самой разнообразной специфичности; возникновение же определенной специфичности зависит от природы антигена, присутствующего во времясвертывания полипептидной цепи. Согласноинструктивной теории, специфическое антитело не может образоваться в отсутствие соответствующего антигена.2. Селекционная теория (теория отбора),которую в 50-х годах выдвинули Макферлейн Вернет и Нильс Ерне (MacfarlaneBurnet, Niels Jerne), постулирует, что антиген регулирует только количество синтезируемых специфических антител.
Согласноэтой теории, антиген-связывающие участкиспецифических антител полностью детерминированы еще до встречи с антигеном.33.9. Конец инструктивной теорииИнструктивная теория предсказывала, чтоесли молекула антитела будет развернута(денатурирована), а затем вновь свернется(ренатурируется), то ее специфичность будетутрачена. Этому предсказанию противоречили экспериментальные данные по ренатурации рибонуклеазы, полученные в лаборатории Христиана Анфинсена (ChristianAnfinsen). Вспомним, что денатурированнаярибонуклеаза спонтанно восстанавливаетисходную трехмерную структуру, специфичность и каталитическую активность послеудаленияденатурирующегоагента(разд. 2.12).
Для ренатурации присутствиесубстрата не требуется. Этот принципиально важный факт относительно рибону240Часть V.Молекулярная физиологияклеазы послужил стимулом для постановкианалогичныхопытовсантителами(рис. 33.11). Были взяты Fab-фрагменты антител против ДНФ; использование фрагментов относительно небольшого размера,а не целых антител значительно упрощаетэксперимент. Fab-фрагмент обрабатываливысокоэффективнымденатурирующимагентом - 7М солянокислым гуанидином.ДенатурированныйтакимобразомFab-фрагменттерял сродство к гаптену(ДНФ). Данные гидродинамического и оптического анализа свидетельствовали о том,что конформация денатурированного Fabбыла близка к случайному клубку. Далеегуанидин-HCl удаляли путем диализа; приэтом денатурированный Fab восстанавливалисходную пространственную структурув отсутствие гаптена ДНФ.
Самым поразительным было то, что ренатурированныйFab обладал высоким сродством к динитрофенольным гаптенам. Поскольку ренатурация происходила в отсутствие гаптена, неоставалось сомнений, что специфичностьучастка связывания антигена определяетсятолько последовательностью аминокислотбелка-антитела. Результат этого эксперимента свидетельствовал в пользу отбораи противоречил основному предсказаниюинструктивной теории. Более того, было обнаружено, что клетки, продуцирующие антитела, способны синтезировать их в большомколичестве в отсутствие антигена. Этоокончательно подтвердило основной тезисселекционной теории: антиген влияет на количество продуцируемых специфических антител, но не на их аминокислотную последовательность или трехмерную структуру.33.10.
Иммуноглобулины миеломыи гибридомы гомогенныКак же могут синтезироваться специфические антитела до появления антигенов? Гетерогенность антител и трудности анализасмеси их молекул на протяжении многих летслужили препятствием к изучению этой проблемы. Выйти из этого положения удалосьпутем использования такого объекта исследования, как множественная миелома - злокачественное перерождение клеток, продуцирующих антитела. При этом виде ракапроисходит перерождение одного лимфоцита или плазматической клетки, что ведетк неконтролируемому клеточному делению.Следовательно, в этом случае образуетсябольшое число клеток одного типа.
Они составляют клон, т.е. происходят от однойРис. 33.11. Fab-Фрагмент анти-ДНФ-антител восстанавливает способность к связыванию ДНФ после денатурации (развертывания структуры) и последующейренатурации (восстановленияисходной структуры) в отсутствие антигена. Этот опыт показывает, что специфичностьопределяется природой последовательности аминокислот.клетки и имеют одни и те же свойства.
Такиеопухоли секретируют большие количествакакого-то одного иммуноглобулина. Иммуноглобулины миеломы обладают нормальнойструктурой и во всех отношениях соответствуют норме, но каждый из них представляет собой гомогенный образец одного измногочисленных антител, присутствующихв данном организме. Миеломы развиваютсяу мышей. Эти опухоли можно трансплантировать другим мышам; после пересадки отодной мыши другой опухоль пролиферирует. Более того, в таких продуцирующихантитела опухолях из поколения в поколение синтезируется одно и то же антитело.Именно это обстоятельство привело к тому,что основные достижения молекулярнойиммунологии связаны с изучением гомогенных миеломных иммуноглобулинов.Сезар Милстайн и Джордж Кёлер(Cesar Milstein, Georges Kohler) обнаружили,что можно получить в большом количествеантитела практически любой заданной специфичности посредством слияния клетки,продуцирующей антитело, с клеткой миеломы.
Для этого мышь иммунизируютопределенным антигеном и спустя несколько недель удаляют у нее селезенку. Далее берут смесь иммунокомпетентных клетокэтой селезенки и in vitro вызывают их слияние с клетками миеломы. Затем выделяютгибридные клетки путем культивированиясмеси всех клеток в среде, поддерживающейрост только гибридных (но не исходных)клеток.
В некоторых из полученных гибридных клеток сохраняются неопластические свойства миеломных клеток, и приэтом они синтезируют антитела заданнойспецифичности. Такие клетки гибридомы какв первом, так и во всех последующих поколениях устойчиво продуцируют большиеколичества гомогенных антител со специфичностью, детерминированной исходнойклеткой селезенки. К настоящему временитаким путем получено много различных моноклональных антител, которые используются в аналитических целях как высокоспецифические реагенты. Например, моноклональные антитела против определенноголекарственного средства или гормона позволяют определить его содержание в жидкостях тела даже при крайне низкой концентрации.33.11.
Каждая L- и Н-цепь состоитиз вариабельного и константного участковПри множественной миеломе в мочебольных, как правило, появляются большие33. Иммуноглобулины241Рис. 33.12.Легкая цепь иммуноглобулинасостоит из вариабельной и константной областей.Рис. 33.13.Тяжелая цепь IgG также состоит из вариабельной и константной областей.242Часть V.Молекулярная физиологияколичества аномальных белков.
На эти белки обратил внимание еще в 1847 г. ГенриБенс-Джонс (Henry Bence-Jones) в связи с ихнеобычными свойствами: они выпадаютв осадок при нагревании до 50°С и вновьрастворяются при кипячении. Оказалось,что белок Бенс-Джонса - это димер L-цепейиммуноглобулина, продуцируемого миеломой больного; этот белок послужилудобным исходным материалом для анализа последовательности аминокислот в L-цепях.В 1965 г. было проведено первое полноеопределение последовательностей аминокислот в миеломных L-цепях, содержащих214 аминокислотных остатков. Эти исследования показали, что у разных больных белкиБенс-Джонса различаются по последовательности аминокислот.
Самое удивительное состояло в том, что различия касалисьтолько N-концевой половины полипептидных цепей. Каждый из исследованныхбелков Бенс-Джонса характеризовался уникальной последовательностью аминокислотв положениях от 1 до 108, но начиная с положения 109, последовательность ряда белковБенс-Джонса была идентичной. Следовательно, L-цenu состоят из вариабельногоучастка (остатки 1-108) и константного(постоянного) участка (остатки 109-214).Такое явление не имело прецедента в белковой химии.Не все L-цепи имеют один и тот же константный участок. Существует два типаL-цепей, обозначаемых соответственно каппа (χ) и лямбда (λ), которые во многомсходны между собой.
Так, оба типа L-цепейсостоят из 214 остатков, содержат вариабельную N-концевую и константную С-концевую половины. Каждая из половин χ- и λцепей образует петлю из-за наличия внутрицепочечной дисульфидной связи. С-концевым остатком цепей обоих типов являетсяцистеин, который участвует в образованиидисульфидного мостика с Н-цепью.
Наконец, χ- и λ-цепи содержат идентичные аминокислотные остатки в 40% положений, т. е.проявляют примерно такую же степень гомологии, как α- и β-цепи гемоглобиначеловека.Константные участки всех χ-цепей идентичны, за исключением положения 191, гдеможет стоять либо лейцин, либо валин. Этоаллотипическое различие наследуется поклассическому правилу Менделя. λ-Цепитакже вариабельны по положению 191, гдеможет стоять лизин или аргинин.Н-цепи содержат 446 аминокислотныхостатков. Сравнение последовательностейН-цепейиммуноглобулинов,продуцируемых разными миеломами, выявило, чтои в этом случае вариабельными оказываются первые 108 остатков (от N-конца).
Следовательно, тяжелые цепи, подобно легким,состоят из вариабельной (V) и константной(С) области. Вариабельные области Н- и Lцепей но размеру одинаковы, а константные - различны: в Н-цепях этот участок в3 раза длиннее, чем в L-цепях (рис. 33.13).33.12. Участок связывания антигенаобразован гипервариабельнымифрагментами L- и Н-цепейКак уже упоминалось выше, в состав антиген-связывающего фрагмента F ab полностью входит L-цепь и частично - Н-цепь.Каков относительный вклад каждой из этихцепей в связывающую активность? Первыесведения в этом отношении были полученыпри сравнении последовательностей аминокислот в большом числе миеломных белков.Обнаружилось, что вариабельные областиL- и Н-цепей вовсе не равномерно вариабельны, а именно три участка L-цепи и четыре Н-цепи проявляют значительно большуюизменчивость, чем другие части вариабельных областей (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
