Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 63
Текст из файла (страница 63)
Участки антител, связывающиеантиген, подобны активным центрамферментовУчастки связывания антигена в молекулахантител во многих отношениях сходны с активными центрами ферментов.1. Константы связывания для гаптеновбыли определены методами равновесногодиализа и спектроскопии. Например, присоединение окрашенного гаптена типа динитрофенильного производного тушит флуоресценцию остатков триптофана в белке-антителе. Степень тушения служит меройнасыщения участков связывания в молекулебелка.
Для большинства гаптенов константы связывания лежат в пределах от10-4 до 1 0 - 1 0 М. Следовательно, стандартная свободная энергия связывания составляет от —6 до — 1 5 ккал/моль, т. е. лежитв границах, характерных для фермент-субстратных и фермент-коферментных комплексов. Кроме того, комплексы гаптен-антитело образуются под действием тех жесил, что и фермент-субстратные комплексы. Сочетание слабых нековалентныхсвязей типа электростатических, водородных и вандерваальсовых обеспечиваетпрочное и специфическое связывание.2. Проверяли способность антител к декстрану (полисахариду, состоящему из остатков глюкозы) связывать олигомеры.
Обна-ружили, что полное связывающее сродствопроявляется в отношении олигомера, состоящего из шести остатков глюкозы. Здесьнапрашивается сравнение с лизоцимом,у которого в щели активного центра размещается тоже шесть углеводных остатков. Изэтого сопоставления следует, что длинасвязывающего участка в молекулах антителпротив декстрана составляет 25 А.3. На основе спектроскопических свойствряда гаптенов можно получить информацию о степени полярности участков связывания в молекулах антител. Так, некоторыенафталины, находясь в высокополярномокружении (например, в воде), дают слабуюжелтую флуоресценцию, а в выраженно неполярном окружении (например, в гексане) - интенсивно голубую. Если такой нафталиновый гаптен присоединяется к специфическому антителу, то появляется интенсивно голубая флуоресценция, что указывает на изгнание воды из участка связывания.
Как правило, участки связыванияпредставляют собой неполярные ниши в молекуле антитела; это увеличивает прочностьсвязывания антигена по причинам, которыеуже обсуждались применительно к ферментсубстратному взаимодействию (разд. 6.8).4. Гаптен довольно точно соответствуетсвязывающему участку по структуре.
Специфичность связывания, безусловно, очень высока, но не абсолютна. Гаптен прочно удерживается в участке связывания, имея, такимобразом, малую свободу вращения. Константа скорости связывания для многих гаптеновсоставляетоколо108 М-1•с-1.Столь высокая константа свидетельствуето том, что скорость процесса контролируется скоростью диффузии. Связывание гаптена не сопровождается, по-видимому, существенными структурными перестройками.лее при электрофорезе препарата антителпротив ДНФ или других специфических антител выявляется множество полос белка.Ферменты же при электрофорезе дают однуполосу или небольшое число отдельных полос (например, изоферменты лактат-дегидрогеназы).Гетерогенность антител с данной специфичностью определяется самой природойиммунного ответа.
В чем причина гетерогенности? Оказалось, что антитела, продуцируемые одной клеткой, гомогенны. Однако различные клетки образуют разные поструктуре антитела. Антитела против ДНФсинтезируются большим количеством различных клеток, что и обусловливает ихгетерогенность.33.5. При ферментативном расщеплениииммуноглобулина G образуются активныефрагментыИммуноглобулин G имеет массу 150 кДа.При изучении такого большого белка целесообразно предварительно расщепить егона активные фрагменты. В 1959 г. РодниПортер (Rodney Porter) показал, что приограниченном протеолизе папаином имму-33.4. Препараты антител с определеннойспецифичностью обычно гетерогенныРис. 33.6.Антитела имеют существенное отличие отферментов: большинство нормальных антител с определенной специфичностью, например антитела против ДНФ, неоднородны помолекулярному составу.
Анализ связываниядинитрофенильных гаптенов с препаратоманти-ДНФ-антител выявил целый набор величин сродства. Некоторые молекулы антител связывают ДНФ с К = 10-6 М, тогдакак другие - с К = 10 - 1 0 М. В отличие отэтого ферменты, как правило, характеризуются только одной константой связывания данного субстрата или кофермента. Да-33. ИммуноглобулиныФлуоресценцияε-дансиллизина отчетливо меняется присвязывании этого гаптена соспецифическими антителами.Сдвиг максимума флуоресценции в сторону более короткихволн и увеличение интенсивности флуоресценции свидетельствуют о том, что связываниегаптена происходит в неполярном участке.237Рис.
33.7.Протеолитическое расщепление иммуноглобулина G (IgG).Рис. 33.8.Схематическое изображениерешетки, формирующейся приобразовании перекрестных связей между IgG (показано синимцветом) и антигеном (показаножелтым цветом).ноглобулин G расщепляется на три активных фрагмента массой по 50 кДа. Двафрагмента связывают антиген. Их обозначили Fab (ab - от англ.
antigen binding - связывающий антиген, F - от англ. fragment - фрагмент), каждый из Fab содержитпо одному участку связывания гаптена илиантигена, причем по связывающему сродству этот участок не отличается от всей мо238Часть V.Молекулярнаяфизиологиялекулы в целом. Однако, будучи одновалентным (т.е. имея один участок связывания), Fab не дает осадка с антигеном; этимFab отличается от интактной молекулыиммуноглобулина G, содержащей два идентичных участка связывания антигена. Иммуноглобулин G может дать осадок с антигеном, содержащим не одну, а несколькоантигенных детерминант. При этом формируется структура в виде протяженной решетки, где каждая молекула антитела образует перекрестные связи с двумя и болееантигенами и наоборот (рис. 33.8).
Осадокдостигает наибольшего размера, если антитело и антиген присутствуют в эквивалентных количествах.Третий фрагмент (также 50 кДа), обозначаемый F c , не способен к связыванию антигена, но обладает другими биологическиважными функциями. В отличие от Fab этотфрагмент способен проникать через плацентарную мембрану. Следовательно, способность иммуноглобулина G проходитьсквозь плаценту и попадать в систему кровообращения плода определяется наличиемна Fc специфического участка, обеспечивающего перенос через плаценту.
На Fc имеетсятакже участок связывания комплемента.Связывание антитела с антигенной детерминантой на поверхности чужеродной клеткичасто ведет к лизису последней. Такой результат взаимодействия антитела с антигеном опосредован группой белков, носящихобщее название комплемент. Присоединение одного из этих белков к комплексу антиген—антитело и запускает последовательность реакций, приводящих к лизису чужеродной клетки. В обозначении фрагмента Fcиндекс «с» (от англ. cristallizable кристаллизуемый) указывает на способность этогофрагмента кристаллизоваться, Обнаружение этого свойства послужило первым указанием на гомогенность F c ; что касаетсяфрагментов F a b , то они гетерогенны и обычно не кристаллизуются.33.6. Иммуноглобулин G состоитиз L- и Н-цепейСледующий важный шаг в развитии иммунологии был сделан также в 1959 г., когдаДжералду Эделману (Gerald Edelman) удалось показать, что иммуноглобулин G состоит из полипептидных цепей двух видов.Белок обрабатывали следующим образом:дисульфидные мостики в молекуле восстанавливали меркаптоэтанолом; далее разрушали нековалентные связи 6 М раствороммочевины.
При хроматографическом анализе смеси было обнаружено, что иммуноглобулин состоит из полипептидных цепей массой 25 и 50 кДа, обозначенных соответственно как легкие (L) и тяжелые (Н) цепи.Впоследствии Портер подобрал болеемягкие условия обработки, позволившие реконструировать иммуноглобулин G из двухН- и двух L-пепей. На основе этих исследований он предложил модель (рис.
33.9)субъединичной структуры иммуноглобулина G, в соответствии с которой каждаяL-цепь соединена с Н-цепью дисульфиднойсвязью. Н-цепи, кроме того, связаны междусобой по крайней мере одной дисульфиднойсвязью. В целом субъединичная структураиммуноглобулина G L 2 H 2 .Далее удалось определить, какие участкипредложенной структуры соответствуютфрагментам, образующимся при расщеплении папаином. Папаин отщепляет Н-цепи состороны С-конца от дисульфидного мостика, соединяющего L- и Н-цепи.
В итоге Fabсостоит из целой L-цепи и аминоконцевойполовины Н-цепи, тогда как Fc состоит изС-концевых половин обеих Н-цепей, ЧастьН-цепи, содержащаяся в F a b , обозначаетсяFd.4возрастает в 10 раз по сравнению со связыванием в одном участке. Не исключено, чтоподвижность шарнирного типа играет также определенную роль и в передаче информации от Fab-единиц на F с -единицу.Рис. 33.9.СубъединичнаяструктураIgG — L 2 H 2 . F ab -фрагменты,высвобождающиеся при расщеплении папаином, показанысиним цветом, Fc-фрагмент красным.33.7.
Иммуноглобулин G - гибкаяY-образная молекулаЭлектронно-микроскопические исследования, проведенные Робином Валентайноми Майклом Грином (Robin Valentine,Michael Green), показали, что иммуноглобулин G имеет форму буквы Y и что гаптенприсоединяется на концах Fab-единиц.Fс-единица и две Fab-единицы в интактномантителе соединены между собой своего рода шарниром, благодаря чему угол междуFab-единицами может меняться быстро ив большом диапазоне величин (рис. 33.10).Этот вид подвижности (гибкости) шарнирного типа усиливает комплексообразованиемежду антигеном и антителом, так как способствует лучшему связыванию поливалентных антигенов. В самом деле, таким путем расстояние между антиген-связывающими участками на концах Fab-единиц может быть приведеновсоответствиес расстоянием между специфическимидетерминантами на антигене (например, навирусе, имеющем много повторяющихсясубъединиц).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
