Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 53
Текст из файла (страница 53)
Retroviruses, Ann.Rev. Biochem., 47, 35-88.Reddy V.В., Thimmappaya В., Dhar R.,Subramanian K.N., Zain B.S., Plan J.,Ghosh P.K.,Celma M.L.,Weissman S. M., 1978. The genome of simianvirus 40, Science, 200, 494-502.ГЛАВА 31Перестройки генов:рекомбинация,транспозиция иклонированиеТема настоящей главы - перестройка геновпутем перемещения крупных участков ДНК.Прежде всего мы обсудим процесс генетической рекомбинации, при котором новая молекула ДНК возникает путем разрыва и воссоединения цепей ДНК.
Вероятность генетической рекомбинации существенно увеличивается при наличии обширных участковгомологии между взаимодействующимимолекулами ДНК. Были выделены промежуточные продукты рекомбинации, а сравнительно недавно был охарактеризовани фермент, катализирующий взаимный обмен цепей ДНК. Затем мы обсудим транспозицию - перемещение гена из одной хромосомы в другую или с одного места надругое в пределах одной хромосомы. В отличие от общей рекомбинации для транспозиции не нужны протяженные участки гомологии. У прокариот присутствие так называемых последовательностей-вставок, илиIS-элементов (от англ. insertion sequences),сообщаетподвижностьнеродственнымфрагментам ДНК, обеспечивая их соединение.
Рекомбинация и транспозиция сыграливажную роль в эволюции, так как они приводили к возникновению новых геномов. В конце настоящей главы мы рассмотрим конструирование новых комбинаций геновв пробирке и их выражение в клетках-хозяевах. Гены можно ковалентно соединитьс ДНК плазмид и вирусов с помощью рестриктирующих эндонуклеаз и ДНК-лигазы.
Такие рекомбинатные молекулы ДНК196Часть IV.Информациямогут реплицироваться и экспрессироватьсяв подходящих клетках-хозяевах. Кроме того, мы обсудим важность клонирования генов и возможность его практического применения. Исследования рекомбинациии транспозиции и разработка методов клонирования идут исключительно быстрымтемпом.
В результате этих работ возникаютновые плодотворные методы изучения геномов, которые позволяют глубже проникнуть в механизмы их эволюции и выражения.31.1 В основе генетической рекомбинациилежат разрыв и воссоединение цепей ДНКПри генетической рекомбинации возникаетмолекула ДНК, последовательность которой происходит частично от одной родительской молекулы, а частично от другой.Исследования клеток Е. coli, зараженныхсмесью фагов Т4, меченных 32Р и бромдезоксиурацилом,позволилиполучитьпредставление о молекулярной природе рекомбинантных молекул. Плавучая плотность ДНК, меченной бромурацилом, значительно выше, чем плотность ДНК, меченной 32Р, так что родительские молекулыможно отделить друг от друга и от рекомбинантных молекул центрифугированием вградиенте плотности хлористого цезия(CsCl).
Результаты опытов по центрифугированию показали, что после заражениясмесью фагов рекомбинантные молекулы32содержат и Р, и бромурацил. Структурагибридных молекул зависела от того, происходил ли во время их образования синтезДНК. В отсутствие синтеза ДНК 32Р-ДНКв составе рекомбинантных молекул не былаковалентно соединена с меченной бромурацилом ДНК. При нагревании выше температуры плавления двухспиральных молекулгибрид диссоциировал на легкий и тяжелыйкомпоненты. Фрагменты родительских молекул в этом гибриде удерживаются вместев результате спаривания оснований; поэтому этот промежуточный продукт называется составным (рис.
31.3). Если же синтезРис. 31.1.Перенос генетической информации от одной клетки Е. coliк другой. На этой электронноймикрофотографии видны двеклетки Е. coli, соединенные припомощи пиля во время коньюгации. ДНК переносится черезпиль из донорной клетки в акцепторную. (Печатается с любезногоразрешенияд-раCharles Brinton и д-ра JudithCarnahan.)31. Перестройки генов197ДНК происходил, одноценочечные пробелыв составном промежуточном продукте заполнялись ДНК-полимеразой I и концы соединялись ДНК-лигазой.
Образовавшуюсярекомбинатную молекулу уже нельзя былоразделить на легкий и тяжелый компоненты, так как куски ДНК были ковалентносоединены. Эти эксперименты показали,что одноцепочечные участки ДНК являются промежуточными продуктами генетической рекомбинации и что в этом процессеучаствуют ферменты.31.2. При генетической рекомбинациипроисходит спаривание гомологичныхцепей ДНК с образованием двухцепочечного промежуточного продуктаИзображение промежуточных продуктов генетической рекомбинации было полученометодом электронной микроскопии.
В этихисследованиях была использована ДНКплазмид Е. coli. Как мы вскоре увидим (разд.Рис. 31.2.Электронная микрофотография кольцевой молекулы ДНК,содержащей гены устойчивости к нескольким антибиотикам. Такие плазмиды (факторыR - от англ. resistance - устойчивость)сообщаютклеткамустойчивость к различным веществам, которая может передаваться другим клеткам.
(Печатается с любезного разрешения д-ра Stanley Cohen.)Рис. 31.4.Рис. 31.3.198Составнойпромежуточныйпродукт рекомбинации ДНКфага Т4 в зараженных бакте32риях. Меченная Р ДНК показана красным цветом, а ДНК,меченная бромурацилом,- синим.Часть IV.ИнформацияЭлектронная микрофотография молекул ДНК в процессерекомбинации:А - промежуточный продукт в форме восьмерки, состоящий из двух молекул Д Н К ; Б - при расщеплении этого промежуточногопродуктарестриктирующейэндонуклеазой образуется хформа. [Potter H., Dressier D.,Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 76,1089 (1976).]Рис. 31.5.Предполагаемая схема расщепления двух молекул ДНК, соединенных в негомологичных(А) и в гомологичных (Б) участках. Наблюдаемая симметрияχ-форм (как на рис. 31.4, Б) показывает, что молекулы ДНКв форме восьмерок соединеныв гомологичных участках.31.4), эти небольшие кольцевые двухцепочечные ДНК автономно реплицируютсяв бактериальной клетке. В присутствиихлорамфеникола число плазмид в однойбактерии увеличивается примерно с 20 до1000.
Этот антибиотик - ингибитор синтезабелка - подавляет репликацию бактериальной хромосомы, но не ингибирует репликации плазмид. Итак, бактериальная клеткаоказывается наполненной молекулами плазмид, способными к рекомбинации. Электронная микроскопия плазмид, выделенныхиз этих клеток, показывает, что примерночетверть из них представляют собой димеры в форме восьмерок (рис. 31.4, А). Затем эти димеры расщепили рестриктирующей эндонуклеазой EcoRI. разрезающеймономер плазмиды в строго определенномместе.
Если бы димеры были взаимозацепленными друг с другом мономерами иликольцами двухкратной длины, то под действием рестриктирующей эндонуклеазыобразовались бы палочки одинаковойдлины. С другой стороны, если два плазмидных кольца ковалентно соединеныв области участка гомологии, должна бытьвидна структура с четырьмя ветвями в форме греческой буквы χ. В действительностипочти все восьмерки превращаются в χформу (рис. 31.4, Б).
Это служит надежнымподтверждением, что восьмерки представляют собой промежуточные продукты репликации. В пользу этого вывода говорит и то,что у некоторых мутантов Е. coli, дефектных по рекомбинации, восьмерки не образуются.Какова структура области перекресткадвух геномов в восьмерках? Точка контакта(пересечения) χ-форм всегда делит всюструктуру на две пары плеч равной длины.Это означает, что геномы соединяютсяв области гомологии (рис.
31.5). Если быплазмиды соединялись в области негомологичных последовательностей, то длины всехчетырех плеч распределялись бы случайнымобразом. Кроме того, точка контакта располагается примерно с равной вероятностьювдоль всей плазмиды; отсюда следует, чтоспаривание может происходить во многихположениях. Способ соединения нитейв области перекреста был исследован с помощью его избирательной денатурации. Наэлектронных микрофотографиях видно, чточетыре двухцепочечные молекулы в местахсоединения двух геномов отходят от кольца,31.
Перестройки генов199Рис. 31.6.А - электроннаямикрофотография χ-формы; Б - схема молекулы, изображенной на фотографии. Участок гомологии(богатый АТ-парами оснований) был избирательно денатурирован формамидом, чтобыбыло видно соединение цепейв области перекреста. [Potter Н., Dressier D., Cold SpringHarbor Symp. Quant. Biol., 43,973 (1979).]состоящего из одиночных нитей (рис. 31.6).Затем этот промежуточный продукт можетбыть расщеплен и лигирован, так что образуются две пары различных рекомбинантных молекул (рис. 31.7).31.3. Белок г е c А катализируетАТР-зависимый обмен цепей ДНКпри генетической рекомбинацииПроцесс, который мы обсуждали до сих пор,называется общей генетической рекомбинацией, поскольку обмены могут происходитьмежду любыми парами гомологичных последовательностей в родительских молекулах ДНК.
У Е. coli общая рекомбинация зависит от генов rec. В клетках rec-- бактериальная ДНК не может рекомбинироватьс экзогенными молекулами ДНК. Былиидентифицированы три гена rec: recА, recВи recС. Белки recВ (масса 140 кДа) и recС(128 кДа) - две субъединицы одной нуклеазы, которая расплетает двухспиральную ДНК и расщепляет на куски сначалаодну из расплетенных цепей, а затем дру200Часть IV.Информациягую. Эти куски, содержащие несколько сотен нуклеотидов, подвергаются дальнейшему расщеплению ферментом recВС, обладающим активностью экзонуклеазы. Расплетающая и нуклеазная активности этогоферментного комплекса зависят от гидролиза АТР.
Скорее всего роль белка recВСв рекомбинации сводится к образованиюодноцепочечной ДНК, способной внедритьсяв двухцепочечную молекулу ДНК.Как одноцепочечная ДНК находит гомологичную последовательность в двухцепочечной молекуле, спаривается с комплементарной цепью и вытесняет вторую цепь?Недавно было показано, что эту реакцию катализирует белок recА с массой 40 кДа, который гидролизует АТР и использует выделяющуюся энергию. Продукт этой реакциисостоит из двухцепочечного участка и вытесненной одноцепочечной петли и имеетформу буквы D; он называется D-петлей(рис. 31.8). Образованию D-петли способствует белок, который специфически связывается с одноцепочечной ДНК.
Этот белокиграет также важную роль в репликацииДНК (разд. 24.21); он стабилизирует одноцепочечную ДНК, образовавшуюся под действием нуклеазы recВС, и стимулирует внедрение этой цепи в гомологичную двухспиральную молекулу, катализируемую белкомrесА.31.4. Бактерии содержат плазмиды и другиеподвижные генетические элементыОбщая генетическая рекомбинация приводит к возникновению новых комбинацийспецифических аллелей, но не изменяет расположения локусов. Другими словами, пригомологичнойрекомбинацииABCDEс A'B'C'D'E' легко получится ABC'D'E', но неможет получиться ABXYZCDE или ABE.Такие крупные генетические перестройкиРис.
31.7.Модель генетической рекомбинации, предложенная Робином Холидеем (Robin Holliday).Одна из родительских двухцепочечных молекул изображенасинимцветом,адругаякрасным. Более темная нитьв каждом дуплексе - (+)цепь.Буквами X, Y и Z обозначенытри гена; х, у и z - их аллели. Ви Г - ковалентное соединениеродительских молекул ДНК.Е - иное представление комплекса молекул, изображенного на рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
