Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 55
Текст из файла (страница 55)
Факторы R, имеющие участок RTF,могут переноситься между различными видами бактерий при совместном культивировании.Следовательно,множественнаяустойчивость к антибиотикам может бытьтрансмиссивной.Маленькие плазмиды факторы R лишеныобласти RTF и обычно придают клеткеустойчивость только к одному антибиотику.Например, плазмида R pSC101 длиной 8,2kb несет ген устойчивости к тетрациклину,но она не может быть перенесена путемконъюгации. Однако этот ген r может присоединиться к другой плазмиде, несущейиной ген устойчивости к какому-либо веществу (рис.
31.15). Если эти гены r интегрируют с плазмидой, содержащей областьRTF, возникает трансмиссивная R-плазми-Рис. 31.14.Схематическоеизображениефактора R. Гены RTF (ответственные за конъюгацию и репликацию) показаны зеленымцветом, а гены r (ответственныеза устойчивость к различнымлекарственным веществам) —красным. IS-элементы показаны желтым цветом.Рис. 31.15.Инфекционный фактор R образуется, когда ген r присоединяется к плазмиде RTF.31. Перестройки генов205Рис. 31.16.Перенос гена (показано красным цветом), граничащего собеих сторон с IS-элементами(желтый цвет).
При транспозиции реципиентный участок (синий цвет) удваивается. Одинконец транспозона представляет собой обращенный повтор другого конца.да. Следовательно, плазмиды, являющиесясложными факторами R, образуются извесьма подвижных элементов, обусловливающих, устойчивость к отдельным химическим соединениям.
Такие генетические элементы, способные к переносу, теперь называют транспозонами.31.7. IS-элементы могут присоединятьсяк неродственным генамЧто лежит в основе высокой подвижноститранспозонов? Электронно-микроскопические исследования и определение последовательности нуклеотидов в ДНК показали,что последовательность, расположенная наодном конце транспозона, повторяется надругом конце. Например, концы Tn3-транспозона, кодирующего устойчивость к ампициллину,- представляют собой обращенныеповторы длиной 38 пар оснований. Последовательности нуклеотидов в ДНК рецепиенте, граничащие с обеих сторон с транспозоном, являются прямым повтором последовательности 5-9 пар оснований, присутствовавшей до вставки транспозона(рис.
31.16). Между этими обрамляющими206Часть IV.Информацияпоследовательностями реципиентной ДНКи концевыми последовательностями транспозона нет никакой гомологии. Кроме того,гены rec E. coli не участвуют в процессе интеграции транспозона, что в корне отличаетего от общей генетической рекомбинации.Концы транспозона, возможно, служат ISэлементами, направляя действие нуклеази других белков, участвующих в интеграции.Самое главное заключается в том, чтотранспозон не обязательно гомологичен реципиентной ДНК, так как специфичностьинтеграции определяется в первую очередьДНК-белковыми взаимодействиями, а неспариванием оснований.Самые маленькие подвижные генетические элементы - это последовательностивставки (IS-элементы), которые имеют длину около 1 kb. В отличие от транспозоновIS-элементы не несут никаких генов.
Однакоони оказывают существенное влияние навыражение соседних генов. IS-элементыобычно блокируют транскрипцию дистальных генов транскрипционной единицы.Кроме того, они могут выступать в качественовых промоторов. К тому же IS-элементыспособствуют таким хромосомным перестройкам, как делеции и инверсии. В хромосоме E. coli было обнаружено несколько копий четырех различных IS-элементов (IS1,IS2, IS3 и IS4). К тому же концевые последовательности некоторых транспозонов идентичны одному из этих IS-элементов. По всейвероятности, транспозон образуется в томслучае, когда какой-либо ген оказываетсяокруженным парой IS-элементов.Мы уже видели, что плазмиды и фаги могут обмениваться блоками генов с бактериальными хромосомами.
Кроме того,плазмиды и фаги способны рекомбиниро-31.8. В лаборатории можно сконструироватьновые геномы и клонировать ихв клетках-хозяевахлась возможность создать в лабораторныхусловиях новые комбинации неродственныхгенов. Затем эти новые геномы можно ввести в подходящие клетки и размножить вомного раз с помощью механизмов синтезаДНК клетки-хозяина. Некоторые из такихвведенных в клетки генов могут также транскрибироваться и транслироваться в новомокружении.
Основные этапы клонированияДНК сводятся к следующему (рис. 31.17).1. Создание рекомбинантной молекулы.Интересующий исследователя фрагментДНК ковалентно присоединяется к ДНКвектора. Основное свойство вектора состоит в том, что он может автономно реплицироваться в подходящем хозяине. Например, плазмиды и фаг λ наиболее удобныевекторы для клонирования генов в клеткахЕ. coli. Как будет описано ниже, молекулыРазработанная в последние годы технология рекомбинантных ДНК - важнейшее достижение молекулярной биологии. Появи-31. Перестройки геновРис. 31.17.Синтез и клонирование рекомбинантных молекул ДНК.вать друг с другом.
Было показано, что генетический элемент, отвечающий за устойчивость к тетрациклину, перемещается изплазмиды фактора R в фаг, размножающийся в клетках Salmonella, а оттуда в хромосому Salmonella, затем в фаг λ и из фага λ в trpоперон E. coli и обратно в фаг λ. Этозамечательное путешествие показывает, насколько подвижны гены прокариот. Былобы интересно выяснить, обладают ли геныэукариот столь же высокой подвижностью.207ХимернаяДНК рекомбинантная молекула ДНК, содержащая неродственные гены. От слова химера - мифологическое существо с головой льва, телом козла и хвостом змеи.«...Коей порода была от богов, не от смертных: Лев головою, задом дракони коза серединой, Страшно дыхала она пожирающим пламенем бурным».Гомер, «Илиада», пер.
Н. Гнедича, гл. VI, стих 180.ДНК можно соединить путем лигирования(т.е. воздействием лигазы) фрагментовс липкими одноцепочечными концами илиже с тупыми концами.2. Введение в клетку-хозяина. Большинство бактериальных и эукариотических клеток поглощает голые молекулы ДНК изсреды. Эффективность поглощения низка(примерно 1 на 106 молекул ДНК), но в специально подобранных экспериментальныхусловиях можно трансформировать значительную часть клеток. Существует и другойметод: клетки заражают реконструированными вирионами, содержащими рекомбинантные молекулы ДНК.
В таком синтетическом вирусном геноме интересующийисследователя ген замещает участок вирус-ной ДНК, не имеющий существенного значения для репликации.3. Отбор. Следующий этап состоит в том,чтобы определить, какие клетки несут рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую нужный ген. Такие клоны можно отобрать по признаку присутствия вектора илисамого встроенного гена.
Например, некоторые плазмидные векторы сообщают клетке устойчивость к какому-либо антибиотику. Другой подход состоит в том, чтобыопределить, какие клетки связывают РНК,комплементарную нужному гену, или синтезируют кодируемый им белок. Клоны, содержащие рекомбинантную ДНК, стабильны, по крайней мере в течение нескольких сотен поколений.Клонирование рекомбинантной ДНК ужевнесло большой вклад в наши представления о структуре хромосомы и выражении гена. Многие встроенные гены удалось размножить путем клонирования, что далобольшие количества ДНК для определенияпоследовательности оснований и электронно-микроскопических исследований.
Крометого, с помощью этих клонов были синтезированы в больших количествах белки, которые в обычных условиях образуютсявничтожныхколичествах.Методырекомбинантных ДНК используются такжедля изучения сложных геномов и регуляцииих выражения.31.9. Ферменты рестрикции и ДНК-лигаза необходимые инструменты для получениярекомбинантных молекул ДНКРис.
31.18.208Электронная микрофотография pSC101 - плазмидного вектора, использованного дляклонирования ДНК. (Печатается с любезного разрешенияд-ра Stanley Cohen.)Часть IV.ИнформацияМолекулы ДНК можно легко соединять invitro с помощью рестриктирующих эндонуклеаз (разд. 24.27), ДНК-лигаз (разд. 24.15)и других высокоспецифических ферментов,действующих на ДНК.
В эксперименте пополучению рекомбинантной ДНК векторподготавливают к соединению с клонируемым фрагментом путем расщепленияв одном определенном месте с помощью рестрикционной эндонуклеазы. Например, небольшую плазмиду pSC101 можно расщепить в одном месте ферментом рестрикцииEcoR1.
Если с помощью этого фермента двеРис. 31.19.Соединение молекул ДНКс помощью метода липких концов. Одна из родительских молекул ДНК (показано зеленымцветом) несет гены Р и Q, разделенные участком рестрикции,а другая (красный цвет) несетгены X и У. Одна из рекомбинантных молекул несет геныР и У, а другая - Q и X.к тетрациклину. Затем используют другойметод отбора для выявления клонов, содержащих плазмиду со встроенной ДНК.Второй метод соединения двух неродственных молекул ДНК основан на присоединении poly(dА)-фрагментов к обоим3'-концам одной молекулы и poly(dТ)-фрагментов к обоим 3'-концам другой молекулы(рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
