Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 56
Текст из файла (страница 56)
31.20). Эти гомополимерные последовательности синтезируются терминальнойРис. 31.20.Соединение молекул ДНК с помощью наращивания poly (dA)и poly(dT)-концов (коннекторным методом).дезоксинуклеотидил-трансферазой(терминальной трансферазой) - ферментом, присоединяющим нуклеотиды к 3'-гидроксильной группе цепи ДНК. Эта трансферазав отличие от ДНК-полимеразы не зависитот матрицы, поэтому с ее помощью можноприсоединить последовательности из нуклеотидов только одного тина (обычно длиной 100 остатков).
Ро1у(dА)-концы одной молекулы ДНК отжигают с poly(dT)-концами другой. Длины этих концевых последовательностей могут несколько колебаться,поэтому, прежде чем соединить цепи ДНКлигазой, бреши заполняют с помощьюДНК-полимеразы I. Точно так же можно использовать для соединения различных молекул ДНК и концевые poly(dG)- и poly(dC)последовательности.Третий подход к соединению молекулцепи ДНК расщепить наискосок, то образуются комплементарные одноцепочечныеконцы (липкие концы). Предположим теперь, что фрагмент ДНК, который необходимо ввести в эту плазмиду, образован путем расщепления большой молекулы ДНКэндонуклеазой EcoR1.
Тогда одноцепочечные концы этого фрагмента будут комплементарны концам расщепленной плазмиды. Теперь фрагмент ДНК и плазмидуможно подвергнуть отжигу и соединитьДНК-лигазой (рис. 31.19). Затем бактерииинкубируют в присутствии этой смеси молекул ДНК. Небольшую часть бактерий, несущих плазмиду, отбирают, исходя из тогочто pSC101 сообщает клеткам устойчивость31.
Перестройки генов209Рис. 31.21. Образование липких концовпутем присоединения и расщепления химически синтезированного линкера.ДНК сочетает преимущества метода липкихконцов с универсальнымхарактером(dA—dТ)-метода (коннекторного). К концамфрагмента ДНК или вектора ковалентноприсоединяют химически синтезированныйлинкер, т.е. связующую цепь (длиной от шести до десяти пар оснований), чувствительный к расщеплению каким-либо ферментом рестрикции.
5'-концы десятинуклеотидного линкера и молекулы ДНК фосфорилируют полинуклеотидкиназой и соединяют лигазой фага Т4, которая можетобразовывать ковалентную связь между молекулами ДНК с тупыми концами. Еслиобработать эти концевые участки соответствующим ферментом рестрикции, образуются липкие концы (рис. 31.21). Такимобразом, почти у любой молекулы ДНКможно вызвать образование липких концов,соответствующих специфичности данногофермента рестрикции.устойчивости к тетрациклину и ампициллину (сходный с пенициллином антибиотик).Эту плазмиду пять различных рестриктазрасщепляют в каком-то одном определенном месте каждая (рис.
31.22). ВведениеДНК в участок рестрикции EcoR1 не затрагивает генов устойчивости к антибиотикам.В то же время введение ДНК в участки рестрикции HindIII, SalI или BamHI приводитк инактивации гена устойчивости к тетрациклину; это явление называется инактивацией вставкой (инсерционной инактивацией). Клетки, содержащие pBR322 совставленной ДНК, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину; поэтому их легко отобрать. Клетки, которыене смогли воспринять ДНК вектора, чувствительны к обоим антибиотикам, а клетки, содержащие pBR322 без вставки ДНК,к обоим антибиотикам устойчивы.Другая группа векторов создана на основе плазмиды ColE1, кодирующей колицинЕ - белковый токсин, убивающий некоторыештаммы Е.
coli. Преимущество использования этих колициногенных плазмид в качестве31.10. Плазмиды и фаг лямбда наиболее подходящие векторыдля клонирования ДНК в бактерияхДля увеличения эффективности проникновения рекомбинантных ДНК в клетку и облегчения отбора содержащих такие молекулыбактерий создаются новые векторы. Например, плазмида pBR322 содержит гены210Часть IV.ИнформацияРис. 31.22.Генетическая карта плазмидыpBR322, несущей два генаустойчивости к антибиотикам.Рис. 31.23.Электронная микрофотография плазмид ColE1. (Печатается с любезного разрешенияд-ра Jack Griffith.)векторов состоит в том , что их репликацияне находится под строгим контролем.В клетке, содержащей ColE1, обычно имеется 25 копий плазмиды. Обработка клетокхлорамфениколом блокирует синтез белкаи репликацию клеточной хромосомы. Однако репликация ColE1 в этих условиях продолжается.
В результате в клетках, обработанных хлорамфениколом, может накапливаться 1000 копий ColE1, так что количествоэтой плазмиды достигает примерно половины всей клеточной ДНК 1 .Фаг λ - другой удобный вектор. Большиеучастки его ДНК, имеющей в длину 48 kb,не являются необходимыми для литическойинфекции или интеграции и могут быть замещены чужеродной ДНК. Были сконструированы мутантные фаги λ, предназначенныедля клонирования ДНК. Один из этих мутантов, который называется λgt = λ, содержит два участка расщепления EcoR1 вместопяти, имеющихся в фаге дикого типа(рис. 31.24). После расщепления центральный участок молекулы ДНК этого фага λ можно удалить. Два оставшихся кускаДНК составляют вместе 72% длины всегогенома.
Это количество ДНК недостаточно1Плазмида pBR322 создана на основе ColE1,поэтому она обладает способностью точно также накапливаться в клетках в присутствии хлорамфеникола.- Прим. перев.для упаковки в головку фага λ. Длина ДНК,которая может быть легко упакована в головку, достигает 75-105% длины генома дикого типа. Однако достаточно длинныйфрагмент ДНК (скажем, длиной 10 kb),вставленный между двумя концами ДНКфага λ, позволяет такой рекомбинантноймолекуле ДНК (93% генома) быть упакованной в головке (инкапсидироваться). Почти все инфекционные частицы λ, образованные таким способом, будут содержатьвставленный кусок чужеродной ДНК.
Ещеодно преимущество использования этих вирионов в качестве векторов состоит в том,что они проникают в бактерии с гораздо более высокой эффективностью, чем плазмиды. К настоящему времени разработаныметоды упаковки молекул ДНК in vitroс образованием инфекционных вирионов λ.Для использования в качестве векторов были сконструированы самые разнообразныемутанты фага λ. Некоторые из них могутслужить векторами для вставок фрагментовДНК, достигающих 40 kb.31.11.
Из суммарной геномной ДНК,расщепленной рестриктирующимиэндонуклеазами, можно выделитьс помощью клонирования определенныеэукариотические геныКак уже говорилось в предыдущей главе, исследование эукариотических геномов представляет огромные трудности. Ген длиной1 kb составляет 2,5•10-4 генома Е. coli и всего лишь 3,4•10-7 генома млекопитающих.Методы рекомбинантных ДНК позволяютв настоящее время вводить эукариотическийген в Е.
coli, что сильно упрощает задачу.Эксперимент начинается с частичного расщепления ДНК эукариотического генома,чтобы получить случайные фрагменты сосредней длиной примерно 20 kb (рис. 31.25).К концам этих фрагментов присоединяютсинтетические линкеры, образуют липкиеконцы и затем присоединяют к какому-нибудь вектору, например к ДНК фага λ. Приупаковке ДНК в вирионы in vitro происходит отбор рекомбинантных молекул ДНК,содержащих большие вставки. Затем этимирекомбинантными фагами заражают клеткиЕ.
coli. Получается лизат, содержащий фрагменты эукариотической ДНК, заключеннойв фаги и размноженной примерно в миллион раз. Этот лизат представляет собой би31. Перестройки генов211Рис. 31.24.В качестве вектора для клонирования может быть использован мутант фага λ. В ходе реакции упаковки фага происходитотбор молекул ДНК, содержащих вставку.блиотеку клонированной эукариотическойДНК.Затем в такой библиотеке можно провести отбор для идентификации фаговых клонов, содержащих нужный эукариотическийген. Вычисление показывает, что лишь одиниз 180000 клонов будет содержать уникальный эукариотический ген. Поэтому необходима очень быстрая и эффективнаяпроцедура отбора. Она основана на гибридизации.
Присутствие определенной последовательности ДНК в одной бляшке фагаλ можно выявить с помощью радиоактивноймолекулы комплементарной ДНК или РНКв качестве гибридизационной пробы. Связывание этой пробы можно обнаружить методом радиоавтографии. Таким образом, можно проверить 1 млн. клонов за один день.Итак, клон, соответствующий определенному эукариотическому гену, можно легкоидентифицировать и выделить при условии,что имеется транскрибированная с негоРНК в более или менее чистом виде.212Часть IV.Информация31.12. Эукариотические гены могуттранскрибироваться в бактериальныхклеткахРекомбинантные молекулы ДНК, содержащие бактериальные гены, часто экспрессируются в клетках Е.
coli. Например, клонирование триптофанового оперона Е. coliв составе плазмидного вектора ColE1 приводит к образованию больших количествпяти биосинтетических ферментов, закодированных в этом опероне. Количество этихферментов примерно в 20 раз выше, чемв обычной клетке Е. coli, так как рекомбинантная плазмида представлена многимикопиями.
ДНК дрожжей, простого эукариотического организма, также может экспрессироваться в бактериях. В одном исследовании в качестве клетки-хозяина использовалимутант Е. coli, нуждающийся в гистидине,так как он не содержал имидазолглицеролфосфат-дегидрогеназы. При заражении этого мутанта фагом λ, содержащим фрагментдрожжевой ДНК, появилось несколько бактериальных клонов, которые уже не нуждались в экзогенном гистидине. Вставленныйкусок дрожжевой ДНК нес недостающийген, который экспрессировался с помощьюмеханизмов транскрипции и трансляциибактериальной клетки.Могут ли гены млекопитающих экспрессироваться в бактериях? Для ответа на этотвопрос в клетки Е. coli ввели ген инсулинакрысы (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
