Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 57
Текст из файла (страница 57)
31.26). Отправной точкой этогокДНК комплементарная ДНК, синтезированная обратной транскриптазой наматрице.исследования послужила инсулинома - опухоль поджелудочной железы, выделяющаябольшое количество инсулина. Эта опухольбогата мРНК препроинсулина, предшественника активного гормона (разд. 35.9).С помощью обратной транскрипции этоймРНК была получена двухцепочечная комплементарная ДНК (кДНК), а затем еевключили в плазмидный вектор. Почемуименно кДНК, а не геномную ДНК ввелив Е. соli? Как мы уже говорили, многие эукариотические гены содержат вставочные последовательности, которые вырезаются изпервичных транскриптов (разд.
29.16). Поскольку бактерии, по всей вероятности, неспособны удалять эти последовательности,представляется желательным трансформировать их участком ДНК, комплементарным зрелой мРНК. Действительно, оказалось, что несколько бактериальных клонов,трансформированныхинсулиновойкДНК, синтезируют небольшое количествопредшественника инсулина (около 100 копий на клетку). Недавно был получен ещеодин важный результат: последовательность ДНК, кодирующая овальбумин куриного яйца, экспрессируется в клетках Е. coli.Около 1,5% белка, синтезированного в таких трансформированных бактериях, представляет собой полные молекулы овальбумина (масса 43 кДа).
Очевидно, гены эукариотических белков могут экспрессироватьсяв бактериях.РНК-дазы, локализованном в плазмидном векторе. При трансформации E.coli начался синтез гибридного белка, в котором соматостатин был присоединен к β-галактозидазе. Пептидную связь между этими двумякомпонентами расщепляли in vitro с помощью бромциана (разд. 2.7). Для этоговстроенный ген содержал кодон метиони-31.13. Химически синтезированный генпептидного гормона соматостатинаэкспрессируется в клетках Е.
coliПоследние достижения в химическом синтезе заданных последовательностей ДНК расширили масштаб и возможности метода рекомбинантных ДНК. Можно синтезироватьde novo гены с практически любой нуклеотидной последовательностью и вставить ихв вектор для введения в Е. coli. Прекраснымпримером такого подхода служит синтез гена соматостатина - 14-членного пептида(рис. 31.27), который обнаруживается в экстрактах гипоталамуса.
Соматостатин подавляет секрецию гормона роста, инсулинаи глюкагона. Молекулу ДНК, кодирующуюэтот пептид, синтезировали путем соединения восьми олигонуклеотидных блоков.Этот ген соединили с геном β-галактози-Рис. 31.25.Стратегия клонирования определенногоэукариотическогогена, начиная с расщеплениясуммарной геномной ДНК.31. Перестройки генов213на перед первым кодоном соматостатина.С-конец соматостатина был свободен, таккак после кодона последнего остатка пептида были расположены два стоп-кодона(рис. 31.27). На долю химерного белка приходилась значительная часть клеточногобелка (около 3%).
Более того, полученныйтаким способом соматостатин обладал биологической активностью.Следовательно,клонированием химически синтезированногогена можно получать функционально активный полипептид.31.14. Перспективы клонирования геновМетод рекомбинантных ДНК открылновые горизонты в молекулярной биологии.Увеличение числа генов путем клонирования в бактериях дает неограниченные количества ДНК для электронно-микроскопического анализа и определения последовательности нуклеотидов. Исследуются специфические участки ДНК, отвечающие заподвижность генов, репликацию ДНКи транскрипцию.
Возникают совершенноновые направления; примером может служить открытие вставочных последователь-ностей во многих эукариотических генах.Появилась возможность быстро картировать сложные хромосомы и разделять их наотдельные элементы, которые поддаютсяразличным манипуляциям. Темпы исследований постоянно нарастают. Кроме того,клонирование генов становится важнымспособом получения определенных белковв больших количествах.
Например, с помощью рекомбинантных молекул можноувеличить в 500 раз количество ДНК-лигазы, образующейся в клетках Е. coli. Наиболее многообещающим представляетсясинтез пептидов и белков эукариот трансформированными бактериями. В недалекомбудущем такие гормоны, как инсулин, и такие противовирусные агенты, как интерферон, будут продуцироваться бактериями 1 .В фармакологии начинается новая эра, которая, по-видимому, окажет глубокое воздействие на медицину.
Исследуются такжевозможности клонирования генов для увеличения сельскохозяйственного производства. Эукариотические гены вводят в настоящее время не только в бактерии, но ив эукариотические клетки. Например, вирусSV-40 был использован в качестве векторадля переноса гена глобина кролика в клетки почек обезьяны. Такие зараженные клетки синтезировали значительные количестваβ-глобина кролика. Этот экспериментальный подход является многообещающим методом расшифровки регуляторныхмеханизмов экспрессии эукариотических генов.ЗаключениеПри генетической рекомбинации новая молекула ДНК образуется путем разрываи воссоединения цепей ДНК.
ВзаимообменРис. 31.26.214Синтез предшественника инсулина - проинсулина в трансформированных клетках Е. coli.может произойти между любой парой гомологичных последовательностей родительских молекул ДНК, и потому этот процесназывается общей генетической рекомбинацией. У Е. coli общая рекомбинация осу-Часть IV.ИнформацияВ А н г л и и и США уже продается инсулин, синтезированный клетками бактерий.- Прим.
перев.1Рис. 31.27.Синтез пептидного гормонасоматостатина клетками Е.соli, трансформированными химически синтезированным геном.ществляется под действием генов rec. БелокrecВС - нуклеаза; она образует одноцепочечную ДНК, которая может внедрятьсяв двухцепочечную молекулу ДНК. Эта реакция связывания одноцепочечной молекулыкатализируется белком recА, который одновременно гидролизует АТР.В генетических перестройках негомологичных локусов участвуют подвижные генетические элементы, называемые транспозонами (элементы, способные к переносу транспозиции).
Плазмиды (небольшие кольцевые двухцепочечные ДНК) - важный классподвижных генетических элементов. Эти дополнительные хромосомы несут гены, отвечающие за инактивацию антибиотиков, метаболизм природных соединений и образование токсинов. Плазмиды могут реплицироваться автономно или интегрироватьс хромосомой клетки-хозяина. ФакторF (фактор плодовитости) - плазмида, сообщающая бактериям способность передаватьгены другим бактериям путем коньюгации.Для коньюгации необходим непосредственный физический контакт между донорной (F + ) и реципиентной (F - - ) клетками.Плазмиды факторы R обеспечивают устой-чивость к антибиотикам.
Более крупные изэтих плазмид содержат фактор переносаустойчивости (RTF), обусловливающийпереход плазмиды в другую бактерию приконьюгации. Некоторые гены, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, могутбыть сцеплены с областью RTF. Поэтомумножественная устойчивость к лекарственным средствам может быть трансмиссивной. Транспозоны обладают высокойподвижностью, так как они обрамлены ISэлементами. Эти концевые последовательности направляют действие белков, участвующих в их интеграции с ДНК. Транспозон не обязательно гомологичен реципиентной ДНК.В лаборатории можно создать новые сочетания неродственных генов и клонироватьих в клетках-хозяевах.
Прежде всего синтезируется рекомбинантная молекула ДНКпутем соединения какого-либо фрагментаДНК с ДНК вектора, который может автономно реплицироваться в подходящем хозяине. Наиболее подходящие векторы - фаглямбда, вирус SV-40 и плазмиды. Ферментырестрикции и ДНК-лигаза - основные инструменты для получения новых молекулДНК. Липкие концы, гомополимерные концевые фрагменты и химически синтезированные линкеры - три способа соединения31. Перестройки генов215молекул ДНК. Рекомбинантные молекулыДНК можно ввести в клетки-хозяева, заражая их реконструированным вирусом илиинкубируя их в присутствии голых молекулДНК. Последний этап заключается в отбореклеток, несущих нужную молекулу рекомбинантной ДНК, с использованием какоголибо отличительного свойства введенногогена (например, устойчивости к антибиотику). Имея рестриктазный гидролизат геномной ДНК, можно клонировать в клетках Е.РЕКОМЕНДУЕМАЯЛИТЕРАТУРАcoli определенные эукариотические гены.Многие эукариотические гены могут транскрибироваться и транслироваться в бактериальных клетках.
Клонирование генов —мощный метод исследования организациии выражения сложных генов. Кроме того,технология рекомбинантных ДНК - весьмамногообещающий метод для синтеза больших количеств генов и белков, имеющихсяв обычных клетках в ничтожных количествах.duplex DNA for homologous pairing,Nature, 281, 191-195.Radding C.M., 1978. Genetic recombination: strand transfer and mismatchС чего начатьGilbert W., Villa-Komaroff L., 1980. Us- repair, Ann. Rev. Biochem., 47, 847-880.eful proteins from recombinant bacteria, Подвижные генетические элементыSci. Amer., 242(4), 74-94.Calos M.P., Miller J.H., 1980. TransCohen S.N.,Shapiro J.A.,1980.
posable elements, Cell, 20, 579-595.Transposable genetic elements, Sci. Cohen S.N., 1976. Transposable geneticAmer., 242(2), 40-49.elements and plasmid evolution, Nature,Abelson J., Butz E. (eds.),1980. 263, 731-738.Recombinant DNA, Science, 209, Kleckner N.. 1977. Translocatable ele1317-1438. (Этот весьма содержа- ments in procaryotes, Cell, 11, 11-23.тельный выпуск журнала Science со- Hicks J., Strathern J.N., Klar A.J.S.,держит много прекрасных статей, по- 1979.
Transposable mating type genes inсвященных структуре и изменениям Saccharomyces cerevisiae, Nature, 282,генов эукариот и экспрессии клониро- 478-483.ванных генов.)Gill R.E., Heffron F.. Falkow S., 1979.Clowes R.С., 1973. The molecule of Identification of the protein encoded byinfectious drug resistance, Sci. Amer., the transposable element Tn3 which is228(4), 18-27.required for its transposition, Nature,Cohen S.N., 1975. The manipulation of 282, 797-801.genes, Sci, Amer., 233(1), 24-33. (Эта Chou J., Lemaux P.G.,Casadaban M.J.,и некоторые другие статьи, посвя- Cohen S.N.. 1979.
Transposition proteinщенные той же проблеме, помещены of Tn3: identification and characteв книге Freifelder D. (ed.), Recombinant risation of an essential represser-conDNA, Freeman, 1978.)trolled gene product, Nature, 282,Stanier R.Y., Adelberg E.A.,Ingra- 801-806.ham J.L., 1976. The Microbial World Bukhari A.I., Shapiro J.A., Adhya S.L.(4 th ed.), Prentice-Hall. (Особенно (eds.), 1977. DNA Insertion Elementsудачна гл. 15, посвященная рекомби- and Episomes, Cold Spring Harborнации, конъюгации и трансдукции.) Laboratory.Broda P., 1979. Plasmids, Freeman.[Брода П. Плазмиды.- М.: Мир,Генетическая рекомбинацияStahl F.W., 1979.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
