Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Эта идеябыла проверена в ряде изящных генетических экспериментов с частично диплоидными бактериями, имевшими два набора геновлактозной области. Один набор содержалсяв бактериальной хромосоме, а второй - в половом факторе F', введенном в клетку приконъюгации. Например, был получен диплоид i + z - - / F i - - z + . У этого диплоида геныi + z - - находятся в хромосоме, а гены i - - z + - вэписоме. Является ли этот диплоид индуцибельным или конститутивным в отношенииβ-галактозидазы? Другими словами, можетли ген i+ бактериальной хромосомы подавлять экспрессию гена z+, расположенногов эписоме? Эксперимент дал совершенно28.2. Открытие регуляторного генаКлючом к изучению механизма индукцииβ-галактозидазы стало открытие того факта, что под действием всех исследованныхиндукторов количество пермеазы и трансацетилазы возрастало прямо пропорционально количеству β-галактозидазы.
Дальнейший прогресс был достигнут при изучении мутантов. Оно показало, что β-галактозидаза, пермеаза и трансацетилаза кодируются тремя генами - z, у и а соответственно - которые расположены друг за другом.Были получены мутанты, утратившие способность к синтезу одного из этих белков.Например, генотип z - - y + a + обозначает, чтоу данного мутанта нет β-галактозидазы, ноимеются в нормальном количестве пермеаза и трансацетилаза. Наибольший интереспредставляет класс мутантов, у которогомутацией затронуты все три белка.
Такиеконститутивные мутанты синтезируют безвсякого индуктора большие количестваβ-галактозидазы, пермеазы и трансацетилазы. Франсуа Жакоб и Жак Моно (FrancoisJacob, Jacques Monod) пришли к выводу, чтоскорость синтеза этих трех белков зависитРис. 28.2.Увеличение количества β-галактозидазы идет параллельноувеличению числа клеток в растущей культуре E.coli. Наклонэтого графика указывает, чтоβ-галактозидазасоставляет6,6% всего синтезируемого белка.28. Регуляция выражениягена в фенотипе113Рис. 28.3.Рис. 28.4.Карта лактозного оперонаи его регуляторного гена.В карте масштаб не соблюден:участки р и о в действительности гораздо меньше, чем кодирующие участки генов.Схема лактозного оперонав репрессированном (А) и индуцированном (Б) состояниях.четкий результат: диплоид индуцибелен, а неконститутивен.
Такой же результат был по-- ++ -лучен и в отношении диплоида i z / F i z .Следовательно, ген i кодирует способныйк диффузии репрессор.114Часть IV.Информация28.3. Оперон - единица координированнойгенетической экспрессииНа основе только что описанных экспериментов Жакоб и Моно постулировали модель оперона, объясняющую регуляцию белкового синтеза. Генетические элементы этоймодели - регуляторный ген, операторныйген и набор структурных генов (рис. 28.3).Регуляторный ген продуцирует репрессор,который может взаимодействовать с операторным геном. В дальнейшем выяснилось,что репрессор представляет собой белок.Операторный ген расположен рядом по соседству со структурными генами, которыеон контролирует.
Связывание репрессорас операторным геном препятствует транскрипции структурных генов. Операторныйген в совокупности со структурными генами, рядом с которыми он расположен, называется опероном. В случае лактозного оперона ген i - регуляторный ген, ген о - ген-оператор, а гены z, у и а - структурные гены.Кроме того, существует еще промоторныйучасток (обозначаемый символом р) длясвязывания РНК-полимеразы.
Этот участокинициирования транскрипции расположенперед операторным геном. Индуктор, например изопропилтиогалактозид (ИПТГ),связывается с репрессором и тем самым нарушает его взаимодействие с операторнымгеном. Теперь гены z, у и а могут транскрибироваться. При этом образуется однадлинная молекула РНК, кодирующая всетри белка (рис. 28.4).
Молекулу мРНК, кодирующую более одного белка, называютполицистронным (или полигенным) транскриптом.28.4. lас-Репрессор - тетрамерный белокПри выделении репрессора лактозного оперона (lас-репрессор) была использована егоспособность связываться с ИПТГ. УолтерГилберт и Бенно Мюллер-Хилл (WalterGilbert, Benno Muller-Hill) установили, чтоlас-репрессор - белок, который связываетсяс ДНК, содержащей lас-оперон, но не связывается ни с одной другой ДНК.
Как и предполагалось, ИПТГ подавляет связываниеlас-репрессора с lас-операторной ДНК.Клетка Е. coli дикого типа содержит всегооколо десяти молекул lас-репрессора. Приочистке репрессора возникли трудности,связанные с тем, что он составляет всего0,001% общего содержания белка. Однакосуществуют isq-мутанты, имеющие, по-видимому, более эффективный промотор гена i.У этих мутантов образуется гораздо больше lас-репрессора. Количество lас-репрессора увеличивается еще сильнее, если использовать трансдуцирующие фаги, несущиеобласть lас. Зараженные таким фагом клетки Е. coli содержат около 20 000 молекул репрессора (примерно 2% всего белка). Этопрекрасный исходный материал для выделения lас-репрессора.Репрессор - тетрамеризидентичныхсубъединиц с массой 37 кДа, каждая из которых имеет один участок связывания с индуктором.
Константа диссоциации ИПТГсоставляет примерно 10 - 6 М. Репрессорочень прочно и быстро связывается с оператором. Константа диссоциации комплексарепрессор-оператор составляет примерно10 - 1 3 М. Такое высокое сродство обусловлено тем, что в клетке Е. coli дикого типа содержится всего несколько молекул репрессора. Константа скорости ассоциации9-1-1поразительно высока - 7•10 м •с . Изэтого следует, что репрессор находит операторный участок, диффундируя вдоль молекулы ДНК (одномерный поиск), а не ищетего, находясь в водной среде (трехмерный1поиск) .28.5. Последовательность оснований вlас-операторе симметричнаНаличие чистого lас-репрессора сделаловозможнымвыделениеlас-оператора1Рис.
28.5.Электронная микрофотография lас-репрессора, связанногос ДНК, содержащей lас-оператор. (Печатается с любезногоразрешения д-ра Jack Griffith.)Недавно проведенные исследования показали,что ситуация намного сложнее: поиск операторарепрессором включает оба указанных механизма и в очень большой степени зависит от ионного состава среды.- Прим. перев.28. Регуляция выражениягена в фенотипе115наламтерминированиятранскрипции(разд. 28.8) и к связыванию пептидногоантибиотика актиномицина D с ДНК1(разд. 25.18) .28.6. Циклический AMP стимулируеттранскрипцию многих индуцибельныхкатаболических опероновРис. 28.6.lас-Репрессор защищает lасоператор от расщепления панкреатической дезоксирибонуклеазой.и определение его последовательности оснований.
Гилберт и его сотрудники, воздействовав ультразвуком на ДНК фага, содержащего lас-область, получили фрагментыдлиной примерно 1000 пар оснований.К смеси фрагментов добавили lас-рспрессори затем профильтровали раствор через нитроцеллюлозную мембрану. ФрагментыДНК, не связанные с lас-репрессором, прошли через фильтр, а комплексы ДНК-репрессор прочно связались с ним. СвязаннуюДНК сняли с фильтра с помощью ИПТГ.Эти элюированные фрагменты ДНК обработали панкреатической дезоксирибонуклеазой в присутствии репрессора. Идеяэтого этапа эксперимента состояла в том,что операторный участок, связанный в комплексе с репрессором, должен быть защищен от расщепления дезоксирибонуклеазой(рис. 28.6). Затем установили последовательность оснований этих операторныхфрагментов, определив последовательностьтранскрибированной с этих фрагментовРНК.
Последовательность оснований этогоучастка оказалась очень интересной: 28 пароснований расположены симметрично относительно оси второго порядка (рис. 28.7).Симметрия репрессора, по-видимому, соответствует симметрии оператора. Этотпринцип узнавания приложим также к сиг116Часть IV.ИнформацияДавно уже известно, что в клетках Е. coli,растущих на глюкозе, активность катаболических ферментов, таких, как β-галактозидаза, галактокиназа, арабинозо-изомеразаи триптофаназа, находится на очень низкомуровне.
Очевидно, было бы совершенно излишним синтезировать эти ферменты в условиях изобилия глюкозы 2 . Молекулярныймеханизм такого ингибирующего действияглюкозы, получивший название катаболитная репрессия, был расшифрован. Ключомк выяснению этого вопроса явились данныео том, что глюкоза понижает концентрациюциклического AMP в клетках Е. coli. Затемобнаружилось, что экзогенный циклическийAMP снимает состояние репрессии, обусловленное присутствием глюкозы. Последующие биохимические и генетические исследования показали, что циклический AMPстимулирует инициирование транскрипциимногих индуцибельных оперонов.Циклический AMP, синтезированныйв отсутствие глюкозы, связывается с БАК(белковый активатор катаболизма) - белком, представляющим собой димер изсубъединиц массой 22 кДа. Комплекс БАКс циклическим AMP стимулирует транскрипцию, связываясь вблизи от многихпромоторных участков; БАК без AMP такой способностью не обладает.
Опытами порасщеплению дезоксирибонуклеазой былоустановлено, что в случае lас-оперона БАКсвязывается рядом с участком связыванияРНК-полимеразы. Точнее, БАК защищаетот расщепления нуклеотиды от —87 до—49, а РНК-полимераза - нуклеотиды от1При детальном изучении механизма воздействия laс-репрессора с оператором оказалось,что вазимодействию не свойственна такая симметрия, так что пока остается не совсем ясным,почему последовательности laс-оператора (имногих других операторов) обладают элементами симметрии,- П р и м . перев.2Далеко не очевидно, почему клетки E.coli, каки многие другие клетки, предпочитают именноглюкозу всем остальным источникам углеродаи энергии и используют ее до тех пор, пока еесодержание не будет исчерпано даже в присутствии значительного избытка других сахаров.—Прим. перев.Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
