Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Например, рифампицин - мощный ингибиторинициации синтеза РНК (разд. 25.18). Известно много антибиотиков, ингибирующих синтез белка (табл. 27.3). В случаенекоторых из них установлен и механизм действия. Стрептомицин - сильно основной трисахарид - препятствует связыванию формилметионил-тРНК с рибосомамии нарушает таким образом правильнуюинициацию белкового синтеза. Кроме того,стрептомицинвызываетнеправильноесчитывание мРНК. Если в качестве матрицы используется poly(U), то наряду с включением фенилаланина (UUU) происходитвключение изолейцина (AUU). Место действия стрептомицина в рибосоме былоопределено в результате опытов по реконструкции компонентов рибосом из чув27.
Синтез белка105Рис. 27.23.Стадия элонгации синтеза белка: связывание аминоацилтРНК, образование пептиднойсвязи и транслокация.ствительных и устойчивых к стрептомицину бактерий. Такие штаммы бактерийразличаются мутацией в единственномгене. Чем же различаются эти рибосомы?Поскольку рибосомы можно диссоциировать и реконструировать in vitro, представлялась возможность выяснить, где расположендетерминантчувствительностик стрептомицину - в 50S- или 30S-субчастице. Гибридные рибосомы из 50S-субчастицустойчивых бактерий и 30S-субчастиц чувствительных бактерий оказались чувствительными к стрептомицину, а рибосомы, полученные из субчастиц в обратной комбинации, устойчивы к нему.
Этот экспериментпоказал, что детерминант чувствительности к стрептомицину локализован в 30S-суб106Часть IV.ИнформацияТаблица 27.3. Антибиотики - ингибиторы синтеза белкаАнтибиотикДействиеСтрептомицинИнгибирует инициацию и вызывает неправильное считываниемРНК (у прокариот)Связывается с 30S-субчастицейи ингибирует связывание аминоацил-тРНК (у прокариот)Ингибирует пептидилтрансферазную активность 50S-субчастицы рибосом (у прокариот)Ингибируетпептидилтрансферазную активность 60S-субчастины рибосом (у эукариот)Связывается с 50S-субчастицейи ингибирует транслокацию (упрокариот)Вызываетпреждевременнуютерминацию цепи, действуя в качестве аналога аминоацил-тРНК(у прокариот и эукариот)ТетрациклинХлорамфениколЦиклогексимидЭритромицинПуромицинчастице.
Следующий эксперимент продемонстрировал,чточувствительностьк стрептомицину определяется каким-тобелком 30S-субчастицы, а не молекулой16S-PHK. Наконец, после ряда сложныхэкспериментов оказалось, что чувствительность к стрептомицину детерминируетсятолько одним белком, входящим в состав30S-субчастицы S12.27.21. Пуромицин вызывает преждевременную терминацию цепи, так как имитируетамииоацилированную транспортную РНКАнтибиотик пуромицин ингибирует синтезбелка, поскольку он освобождает новообразованные полипептидные цепи еше дотого, как завершается их синтез.
Пуромицин-аналог концевого участка аминоацилтРНК аминоациладенозина (рис. 27.24). Онсвязывается с А-участком рибосомы и препятствует связыванию аминоацил-тРНК.Кроме того, пуромицин содержит α-аминогруппу. Эта аминогруппа, подобно аминогруппе аминоацил-тРНК, образует пептидную связь с карбоксильной группой растущей пептидной цепи в результате реакции,катализируемойпептидилтрансферазой.Образующийся продукт представляет собой пептид с ковалентно присоединеннымостатком пуромицина на карбоксильномконце.
Затем пептидилпуромицин сходитРис. 27.24.Структура пуромицина напоминает аминоацилированныйконец аминоацил-тРНК.с рибосомы. Пуромицин был использовандля изучения функционального состояниярибосом. Концепция существования Аи Р-участков возникла в результате опытовс использованием пуромицина для выяснения локализации пептидил-тРНК. Когдапептидил-тРНК находится в А-участке (дотранслокации), она не может вступать в реакцию с пуромицином.27.22. Некоторые короткие пептидысинтезируются без участия рибосомТеперь мы перейдем к другому механизмуобразования пептидной связи в биологических системах. Рассмотрим в качестве примера биосинтез грамицидина S - циклического пептидного антибиотика, состоящегоиз двух идентичных пентапептидов, соединенных «голова к хвосту» (рис. 27.25).
ЭтотантибиотикпродуцируютнекоторыештаммыспорообразующейбактерииBacillus brevis.Биосинтез грамицидина S происходитв отсутствие рибосом или мРНК. Для негонеобходим гораздо более простой синтетический аппарат, состоящий всего лишь издвух ферментов - EI и ЕII. Фермент ЕII(масса 100 кДа) активирует фенилаланин,остальные четыре аминокислоты пентапептидного фрагмента активируются EI (масса180 кДа).
Кроме того, оба фермента уча27. Синтез белка107переносится на иминогруппу L-пролинового остатка, присоединенного к EI, с образованием дипептида. В последующих реакциях участвует только E I . Активированная карбонильная группа остатка пролинав составе дипептида реагирует с аминогруппой валинового остатка, прикрепленного к тому же ферменту, и дает трипептид. Этот процесс повторяется с участиеморнитина и затем лейцина, образуя в результате пентапептид, связанный с ферментом.
С возникновением каждой новой пептидной связи растущий пептид переноситсяна новую сульфгидрильную группу. НакоРис. 27.25.Последовательностьаминокислот в грамицидине S, циклическом пептиде, состоящем издвух одинаковых пентапептидных групп.ствуют в образовании пептидной связи.В этой системе аминокислоты активируются путем образования тиоэфиров, связанных с ферментами. Вместо 3'-концевойгидроксильной группы тРНК активированные аминокислоты присоединяютсяк сульфгидрильной группе EI и EII:Если инкубировать L-пролин, L-валин,L-орнитин и L-лейцин с EI в присутствииАТР, они образуют тиоэфирные связис определенными сульфгидрильными группами ЕI.
Точно так же D-фенилаланинв присутствии АТР образует тиоэфирнуюсвязь с ЕII.Синтез пептида в этой системе инициируется взаимодействием EI и ЕII. ОстатокD-фенилаланина, присоединенный к ЕII,108Часть IV.Информациянец, активированные пентапептиды, присоединенные к двум различным молекуламEI, реагируют друг с другом с образованием циклического грамицидина S.Следует отметить две особенности этогобиосинтетического пути.1. Аминокислотная последовательностьграмицидина S определяется пространственной организацией и специфичностьюферментов EI и ЕII.
На каждую пептиднуюсвязь приходится по меньшей мере однасубъединица белка. Выходит, что этот способ синтеза уступает по экономичностирибосомному механизму. Поэтому пептиды, содержащие более чем примерно 15остатков, не синтезируются с помощьюэтого механизма.2. Синтез грамицидина S напоминаетсинтез жирных кислот в том отношении,что активированными промежуточнымипродуктами в обоих процессах служаттиоэфиры.
Кроме того, EI содержит ковалентно связанный остаток фосфопантетеина. Возможно, этот тиол переносит растущую пептидную цепь с одного участка ЕIна следующий. Фриц Липман (FritzLipmann) предположил, что синтез полипептидных антибиотиков, возможно, представляет собой как бы атавизм, напоминающий о примитивном механизме синтезабелка, который использовался на заре эволюции. Синтез рибосомных белков могвозникнуть в результате эволюции синтезажирных кислот.ЗаключениеСинтез белка (трансляция) зависит откоординированного взаимодействия болеечем 100 макромолекул, к которым, помиморибосом, относятся мРНК, тРНК, активирующие ферменты и белковые факторы.Синтез белка начинается с активации аминокислотаминоацил-тРНК-синтетазами(активирующими ферментами) за счетэнергии АТР.
Синтетазы соединяют карбоксильную группу аминокислоты с 2'- или3'-гидроксильной группой остатка аденозина на 3'-конце тРНК. Для каждой аминокислоты имеется по меньшей мере одинактивирующий фермент. Кроме того, длякаждой аминокислоты имеется хотя бы од-на специфическая тРНК. Все транспортныеРНК, обладающие различной специфичностью, характеризуются общим планомстроения. Это - одиночные цепи РНК длиной примерно 80 нуклеотидов, содержащиенекоторые модифицированные (например.метилированные) производные обычныхоснований.
Последовательности основанийвсех известных тРНК могут быть написаны в виде клеверного листа, в которомпримерно половина нуклеотидов спарена.Кристаллографические исследования с помощью рентгеновских лучей показали, чтомолекула тРНК имеет L-образную форму.На одном конце L-образной структуры находится 3'-концевая ССА-последовательность, являющаяся местом присоединенияаминокислоты, на другом конце, на расстоянии около 80А,- антикодон. Информационная РНК узнает антикодон тРНК,а не присоединенную к тРНК аминокислоту.
Кодон мРНК образует пары основанийс антикодоном тРНК. Некоторые тРНКузнают более одного кодона благодаря тому, что спаривание третьего основания кодона менее избирательно, чем спариваниедвух других (гипотеза «качаний», неоднозначного соответствия; wobble-hypothesis).Синтез белка происходит на рибосомах,образованных из больших и малых субъединиц. В каждом из них примерно две трети массы приходится на долю РНК и однатреть-на белок. 70S-рибосома E.coli (масса 2500 кДа) состоит из 30S- и 50S-субчастиц.Синтез белка происходит в три этапа,называемых соответственно инициацией,элонгацией и терминацией. Информационная РНК, формилметионил-тРНКf и 30Sсубчастица рибосомы соединяются, образуя30S-комплекс инициации. Сигналом началатрансляции служит кодон AUG (илиGUG), которому предшествует богатая пурином последовательность, способная спа27.
Синтез белка109риваться с 16S-pPHK. Затем 50S-субчастица рибосомы присоединяется к этому комплексу, что приводит к образованию 70Sкомплекса инициации, готового к следующему этапу. Цикл элонгации включаетсвязывание аминоацил-тРНК (узнаваниекодона), образование пептидной связии транслокацию. Рост цепи происходитв направлении от N-конца к С-концу.Терминацию синтеза белка осуществляютфакторы освобождения, которые узнаюттерминирующиекодоныUAA,UGAРЕКОМЕНДУЕМАЯЛИТЕРАТУРАС чего начатьMiller О.L., Jr., 1973. The visualizationof genes in action, Sci. Amer., 228(3),34-42.Rich A., Kim S.H., 1978. The threedimensional structure of transfer RNA,Sci.
Amer., 238(1), 52-62.Clark B.F.C.,Marcher K.A.,1968.How proteins start, Sci. Amer., 218(1),36-42.и UAG, что приводит к гидролизу связимежду полипептидом и тРНК. При образовании 70S-комплекса инициации, присвязывании аминоацил-тРНК с рибосомойи на стадии транслокации происходит гидролиз GTP.