PDF (1123296), страница 25
Текст из файла (страница 25)
k2 показывает число актов катализа в единицу времени – число оборотов фермента.Эта система описывается следующими уравнениями:dS/dt = – k1 (S)(E) + k-1 (ES)dE/dt = – k1 (S)(E) + k-1 (ES) + k2 (ES)d(ES)/dt = k1 (S)(E) – k-1 (ES) – k2 (ES)dP/dt = k2 (ES) = υpВажным фактором, от которого зависит скорость ферментативной реакции (равно каталитическая активность фермента)является температура, влияние которой показано на рис 4.5.(Влияние температуры на скорость гидролиза крахмала амилазой. )Из рисунка видно, что с повышением температуры до определенной величины скорость реакции увеличивается. Это можнообъяснить тем, что с повышением температуры движение молекулускоряется и у молекул реагирующих веществ оказывается большевозможности столкнуться друг с другом.
Это увеличивает вероятностьтого, что реакция между ними произойдет. Температура, обеспечивающаянаибольшую скорость реакции, называется о п т и м а л ь н о йтемпературой.Каждый фермент имеет свою оптимальную температуру. В общемдля ферментов животного происхождения она лежит между 37 и 40ОС, арастительного - между 40 и 50ОС. Однако есть и исключения: a-амилазаиз проросшего зерна имеет оптимальную температуру при 60ОС, а каталаза- в пределах 0 - 10ОС. При повышении температуры сверх оптимальнойскорость ферментативной реакции снижается, хотя частота столкновениймолекул увеличивается. Происходит это вследствие денатурации, т.е.потери ферментом нативного состояния. При температуре выше 80ОСбольшинство ферментов полностью теряют свою каталитическую активность.Снижение скорости ферментативной реакции при температурах, превышающих оптимальную, зависит от денатурациифермента.
Поэтому важным показателем, характеризующим отношение фермента к температуре, является еготермолабильность, т.е. скорость инактивации самого фермента при повышении температуры.При низких температурах (0 ОС и ниже) каталитическая активность ферментов падает почти до нуля, но денатурация при этомне происходит. С повышением температуры их каталитическая активность вновь восстанавливается.Люминесцентные методы биоиндикации экологического состояния среды.Смотрят выход фотосинтеза, оценивают флуорисценцию (чем больше на нее ушло,тем хуже ФС).оценивают обилие исостояние водорослей.Флуоресценция хлорофилла как параметр состояния фотосинтезирующих клетокОтдельные звенья трансформации энергии в системе ППФ испытывают влияние различных факторов эндогенной и экзогенной(загрязнение среды) природы.
Это приводит к регуляторным перестройкам ЭТЦ и к изменению характера фотосинтеза.Накопленные данные фундаментальных исследований в принципе позволяют расшифровать последовательность событий отмомента воздействия внешнего фактора до изменения фотосинтеза на уровне его конечных продуктов.
Вместе с тем оченьважно найти такой показатель состояния ЭТЦ, который бы позволял в режиме реального времени непосредственно оцениватьне только эффективность запасания энергии света в ППФ, но и динамику ее изменений в различных условиях существованияклеток (свет, температура, состав минеральных и биогенных элементов) во внешней среде.Именно таким показателем является флуоресценция хлорофилла, локализованного в фотосинтетических мембранах клеток.Флуоресценция хлорофилла.
Не использованная в фотосинтезе энергия поглощенных квантов света диссипирует в тепло илиизлучается в виде флуоресценции. Подавляющая часть флуоресценци генерируется в ФС 2. Вследствие высокой эффективностидезактивации возбужденного состояния П680 и разделения зарядов в РЦ, флуоресценция ФС 2 характеризуется низкимизначениями квантового выхода (1—3%) и времени затухания (100—200 пс). Однако по изменению этих величин можно судитьоб эффективности основного фотосинтетического запасания энергии электронного возбуждения П680 в различных условиях.
Внастоящее время параметры флуоресценции как показатель состояния и эффективности функционирования фотосинтетическогоаппарата широко используются в фундаментальных и прикладных исследованиях. Основная идея состоит в том, чтоуменьшение эффективности запасания света в фотосинтезе приводит к увеличению интенсивности флуоресценцииСложная кинетика нарастания переменной флуоресценции хлорофилла отражает последовательное заполнение различныхпулов пластохинона на акцепторной стороне ФС 2, а кинетика затухания — гетерогенность окисления восстановленного пула.Исходный уровень флуоресценции (Fo) определяется флуоресценцией хлорофилла в условиях, когда все РЦ находятся в«открытом» рабочем состоянии и способны тушить флуоресценцию антенны, поскольку все молекулы первичного хинонногоакцептора QA готовы принять электрон от П680. Если все молекулы QA восстановлены (на свету), РЦ «закрыт», т.к.перенос электронов от П680 на феофитин невозможен в силу электростатического отталкивания.
Поэтому энергия электронноговозбуждения большей частью возвращается в антенну и уровень флуоресценции становится максимальным (Fm). Разницамежду Fm и Fo называется переменной флуоресценцией (Fv= Fm–Fo). Она обусловлена той частью световой энергии,которая в первичных реакциях фотосинтеза утилизируется при открытых РЦ.Изучение фундаментальных механизмов флуоресценции и выяснение их взаимосвязи с работой ЭТЦ и сопряженными с нейпроцессами являются основой для использования параметров флуоресцетции в решении прикладных задач, требующихполучения характеристики физиологического состояния растения. Применение техники с высоким временным разрешениемпозволяет проанализировать кинетики нарастания и спада флуоресценции.
По характеру кинетической кривой и другихпараметров флуоресценции (см. ниже) можно судить об изменениях в цепи электронного транспорта.Флуориметрические методы и аппаратуры для экологического мониторинга водорослей и высших растенийНа кафедре биофизики Биологического факультета МГУ разработан комплекс флуориметрических экспресс-методов и созданытехнические устройства для диагностики состояния фотосинтетического аппарата высших растений и водорослей в природныхусловияхВ режиме реального времени эти методы дают информацию о состоянии фотосинтетического аппарата, эффективностифотосинтеза, а также суточную и сезонную динамику этих характеристик, обилии фитопланктона в природных условиях.
Онипозволяют детектировать наличие повреждений при действии антропогенных загрянений, повышенных интенсивностейсолнечной и УФ-радиации, дефицита элементов минерального питания, температуры задолго до того, как они найдут своевнешнее проявление, в частности уменьшение численности клеток. В этом состоит одно из главных преимуществ экспрессметодов в экологическом мониторинге. На сегодняшний день обосновано применение показателя эффективности запасанияэнергии электронного возбуждения в РЦ. Этот параметр определяется путем сравнения величин интенсивности флуоресценции(F0) при активном состоянии ЭТЦ, когда все реакционные центры открыты, и максимальной интенсивности флуоресценции(Fm) при закрытых реакционных центрах. Закрытие центров вызывается обычно мощной насыщающей вспышкой света, прикоторой восстанавливаются хинонные акцепторы, а центоры переходят в закрытое состояние, где уровень флуоресценциимаксимален (Fm).
Разность величин Fv=Fm−F0 называется переменной флуоресценцией, а отношение(Fm −Fo)/Fm= Fv/Fm (1)равно эффективности использования энергии света в реакционных центрах или эффективности фотохимического тушенияфлуоресценции. Эта величина (Fv/Fm), определенная в адаптированных к темноте или слабому освещению клетках, даетинформацию о максимальной потенциальной активности ППФ. В реальных условиях освещения развиваются процессы (втечение 1–2 минут), ведущие к уменьшению отношения (Fv/Fm), найденного для клеток, адаптированных к темноте.Наиболее важными здесь являются нефотохимические процессы тушения, вызванные энергизацией мембран с образованиемтрансмембранной разности концентрации ионов водорода (∆pH) − движущей силы синтеза АТФ.
Этот вид тушения носитзащитный характер. Он возникает при избыточном образовании ∆pH и насыщении фотосинтеза и способствует дезактивациинеиспользованных возбужденных состояний хлорофилла, предотвращая тем самым образование активных форм кислорода вэтих условиях.В настоящее время принято, что определение величин qP, qN, Fv/Fm, интенсивности флуоресценции F0 с одновременнойрегистрацией температуры и освещенности объектов дает общую информацию о состоянии и обилии клеток. Однако, как видноиз выражений (5–7), изменение коэффициентов qP и qN может быть вызвано разными причинами, иногда действующими впротивоположных направлениях.
Например, интенсивное фотоокисление РЦ может сопровождаться также окислением частиантенного хлорофилла, что приводит к падению величины не только Fm, но и F0.∆pH – зависимое энергизированное тушение – носит «полезный» характер, коррелируя с «полезным» для клетки синтезом АТФв отличие от «каротиноидной» компоненты нефотохимического тушения, имеющего защитное значение.
Соотношение междуэтими компонентами может меняться в зависимости от условий ос- вещения.Помимо фактора светового освещения свой вклад внаблюдаемые изменения параметров флуоресценции (F0, Fm, Fm′, Ft′, Fv/Fm) дают также температура, состав и наличиеэлементов минерального питания, присутст- вие ингибиторов, влияющих как на отдельные этапы ППФ, так и на биосин- тезбелка РЦ.При голодании в условиях недостатка элементов минерального питания и невозможности вследствие этого полностьюреализовать избыточное количество продуктов световой стадии, в клетках развивается циклический поток электронов,восстанавливающий через цепь хлоропластного дыхания пул пластохинонов, что предшествует разделению зарядов в РЦфотосистемы 2.
В результате происходит обращение части электронного потока на уровне первичных хинонных акцепторовфотосистемы 2 и генерация компоненты флуоресценции хлорофилла с временем жизни 2 нс [56]. Это отражается вувеличении общей флуоресценции F0 и в соот- ветствующем снижении отношения (5) Fv/Fm. Описанное явление также носитзащитный характер, так как сброс избытка возбуждения в виде флуоресценции предотвращает активацию молекул кислорода собразова- нием активных форм, которое не происходит за столь короткое времяНа кафедре биофизики был создан зондфлуорометр, способный работать до глубины 200 м, для измерения параметровфлуоресценции (Fo, Fm и (Fm–Fo)/Fm) природного фитопланктона в естественных условиях с одновре- менной регистрациейтемпературы и подводной освещенности. На кафедре разработаны также мето- ды высокотемпературной термолюминесценциихлорофилла для опреде- ления степени инактивации фотосинтетических процессов фитопланктона в природных условияхПерспективы использования флуоресцентных методов в экологическом мониторингеПредставленная методология и комплексное использование флуорометрической аппаратура дают новую информацию опространст- венно-временной изменчивости фитоценоза и могут также служить важ- ной составной частью общей системыэкологического мониторинга со- стояния вод.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
