Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 11)

Однако, не все фотосенсибилизаторы реагируют на красный свет . Пример процесса,индуцируемого синим светом, является фототропизм. Основными рецепторами этих реакций являются флавиновые хромофоры. (за счёт фотосенсибилизированных рибофлавином окислительных реакций происходит активация транспорта ауксинов через мембрану). Ещё к реакциям, которые индуцируются синим светом, относятся каротиногенез, фототаксис.

Фотодинамическими называются фотосенсибилизированные деструктивные процессы в большинстве случаев протекающие с участием кислорода. Фотодинамические реакции разделяются на 2 типа, в зависимости от того, каким способом энергия светового возбуждения передаётся на биологический субстрат.

В реакциях I типа возбуждённый сенсибилизатор может осуществлять ОВР с различными молекуласи (перенося либо электрон, либо атом водорода). В результате образуются реакционноспособные радикалы сенсибилизатора и субстрата, ступающие в химические реакции с кислородом.

В реакциях II типа перенос энергии от возбуждённой в триплетном состоянии молекулы сенсибилизатора происходит к кислороду с образованием синглетной формы кислорода, который окисляет молекулы биологического субстрата.

Однако существую фотодинамические реакции, не требующие участия кислорода. В частности, такие процессы протекают в ДНК. Энергия возбуждения в данном случае передаётся с молекул-сенсибилизаторов на азотистые основания, вызывая их димеризацию(это происходит под действием УФ излучения).Интересно, что данное действие является фотообратимым.

Под действием УФ протекает реакция фотогидратации ДНК, когда к пиримидиновому кольцу присоединяется молекула воды. Однако, это реакция протекает только в одноцепочечных НК, что имеет большое значение для процессов Репликации и транскрипции.

УФ может вызывать появление пиримидовых аддуктов (аддукт – это 2 соединённых пиримидоных основания). Эта реакция имеет значение в качестве способа появления мутаций.

Все вышеприведённые реакции соответствовали коротковолновому УФ излучению.

Теперь рассмотрим реакции, которые вызывает длинноволновое УФ излучение. Данный свет индуцирует в ДНК образование пиримидиновых димеров и одноцепочечные разрывы. Очевидно, что молекула ДНК не может служить первичным хромофором придействии УФ излучения (300-320 нм). Следовательно, и димеры, и разрывы должны образовываться не за счёт прямого поглощения квантов молекулой ДНК, а косвенным путём с участием определённых молекул – хромофором, тесно связанных с ДНК. Зависимость от молекулярного кислорода позволяет считать, что образование этих фотопродуктов идёт по фотодинамическому механизму. Такой механизм осуществляется при наличии следующей комбинации факторов: свет+хромофор+О₂ . Как и любая фотохимическая реакция, фотосенсибилизированный процесс имеет начальную «световую стадию» и последующие «темновые стадии». Наиболее характерные первичные реакции заключаются либо в переносе электрона (или атома водорода), либо в переносе энергии (или электрона) на кислород.

При фотосенсибилизированном образовании кислородо-зависимых одноцепочечных разрывов в ДНК в качестве эндогенных сенсибилизаторов выступают НАДН, 4-тиоуридини 2-тиоурацил. Установлено, что фотосенсибилизированная этими соединениями иницияция разрывов в ДНК осуществляется по фотодинамическому механизму с участием АФК. При этом первичной фотогенерируемой формой кислорода является супероксидный анион-радикал. Однако он обладает малой реакционной способностью по сравнению с радикалом ОН*. Соответственно, фотодинамическую реакцию одноцепочечного разрыва ДНК можно представить как : S à S* à S⁺ + О’₂^- à Н₂О₂ à OH’ à ДНК à одноцепочечный разрыв

Билет 15.

Принцип Франка-Кондона. Люминесценция биологически важных молекул.

Фотопроцессы в биологических системах сопровождаются возникновением электронно-возбужденных состояний, характеризующихся определенной энергией, временем жизни, структурными свойствами.

Полная энергия состояния молекулы Е складывается из энергии электронного возбуждения Ее, колебательной энергии Еv и вращательной энергии Er. Таким образом, при поглощении кванта света молекулой полное изменение энергии можно представить в следующем виде: ашню = дельта Ее + дельта Еv + дельта Er . Энергия вращательных квантов меньше, чем колебательных, а их энергия, в свою очередь, меньше энергии электронных (Er 10 в10 Гц, Еv 10 в 13 Гц, Ее 10 в 18 Гц).

Возможные электронные переходы и энергетические состояния молекулы обычно представляются в виде схемы уровней энергии (Яблонского), где каждый электронный уровень расщепляется на ряд колебательных подуровней, а каждый колебательный — на ряд вращательных подуровней (рис. 1)

При поглощении кванта света молекулой осуществляется переход с самого нижнего колебательного подуровня основного состояния (комнатная температура) на возбужденные уровни S1* и S2*, характеризующиеся колебательными и вращательными подуровнями. В молекулах большинства соединений при возбуждении электронных состояний, расположенных выше S1*, происходит быстрая внутренняя конверсия (с временами порядка 10 в -13 с) за счет перехода с нижнего колебательного подуровня верхнего состояния S2* на верхний колебательный подуровень нижнего состояния S1* с последующей релаксацией (порядок 10 в -12) на самый нижний колебательный подуровень возбужденного состояния S1*. Это означает, что в какое бы возбужденное состояние ни попала молекула (например, в состояние S2*), в течение 10 в -13 — 10 в -12 с она перейдет на нижний колебательный подуровень первого электронного состояния S1*. Именно с этого уровня при переходе на любой колебательно-вращательный подуровень основного состояния S0 и происходит излучение — флуоресценция.

Отсюда следует, что спектр флуоресценции I=f(лямбда), т.е. зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны и квантовый выход флуоресценции фи=число квантов фл/число погл квантов не зависят от длины волны возбуждающего света. Независимость спектра и квантового выхода флуоресценции от энергии поглощенного молекулой кванта называется законом Вавилова.

Поскольку энергия поглощенного кванта частично растрачивается на тепловые колебания, энергия кванта флуоресценции оказывается меньшей, т. е. спектр флуоресценции сдвинут в длинноволновую сторону относительно наиболее длинноволновой полосы поглощения (закон Стокса ) (т.к. E=hc/лямбда, чем меньше энергия, тем длиннее лямбда). Если что рисуем 2 гладких холма, где правый – спектр флуоресценции, а левый – поглощения. Форма полос флуоресценции определяется распределением колебательных подуровней основного состояния, т. е. отражает колебательную структуру основного состояния S0.

Часто распределение колебательных подуровней по энергиям у основного и возбужденного состояний одинаково; следовательно, полосы флуоресценции и поглощения будут зеркально симметричны относительно так называемого (0 — 0)-перехода (единственный переход, имеющий одинаковую энергию поглощения и флуоресценции).

Принцип Франка – Кондона: электронные переходы в молекулах происходят очень быстро (около 10 в -15 с) по сравнению с движением ядер, благодаря чему расстояние между ядрами и их скорости при электронном переходе не успевают измениться. Существует несколько дополнительных формулировок этого принципа: электроны не обмениваются энергией с ядрами; электроны всегда имеют равновесную конфигурацию при любом расположении ядер. Зависимость потенциальной энергии системы от координат ядер многоатомной молекулы в основном и возбужденном состояниях различается. В наиболее простом случае (двухатомная молекула) минимумы кривых потенциальных энергий в основном и возбужденном состояниях сдвинуты, поскольку орбиталь, заполняемая электроном в возбужденном состоянии, занимает большую область пространства, чем в основном состоянии, и положение равновесия в возбужденном состоянии, следовательно, соответствует большему межъядерному расстоянию (поэтому сдвиг). Кроме того, форма таких потенциальных кривых в основном и возбужденном состояниях также различается (рис. 2).

В соответствии с принципом Франка — Кондона наиболее вероятным будет такой переход, при котором не произойдет изменений ни в положении ядер, ни в импульсе (принцип вертикальности перехода между двумя электронными состояниями). Решение волнового уравнения показывает, что хотя при поглощении кванта света возможны различные переходы, однако наиболее вероятным будет переход, обозначенный сплошной стрелкой вверх на рис. 2. Иными словами, наиболее вероятное межъядерное расстояние для молекулы с нулевой колебательной энергией соответствует середине АВ. В случае флуоресценции наиболее вероятным будет испускание из середины CD (сплошная стрелка вниз), что соответствует наиболее интенсивной полосе спектра. Флуоресценция происходит с самого нижнего колебательного уровня первого возбужденного состояния при переходе молекулы в основное состояние. Вероятность перехода из возбужденного в основное состояние может быть описана константой скорости перехода k, которая по физическому смыслу эквивалентна константе мономолекулярной реакции. Кинетика перехода может быть описана реакцией первого порядка dS*/dt=-kS*, где S* - количество возбужденных молекул. После интегрирования волшебным образом I=Io*exp(-kt), k – константа флуоресценции.

При отсутствии безызлучательных процессов (фи= 1) длительность пребывания молекулы в возбужденном состоянии определяется радиационным, или естественным, временем жизни тау0=1/константу флуоресценции. Это то время, в течение которого число возбужденных молекул уменьшается в e раз. В реальных ситуациях квантовый выход обычно меньше единицы, поскольку с флуоресценцией конкурируют безызлучательные процессы: интеркомбинационная конверсия с переходом в триплетное возбужденное состояние, сопровождающееся изменением спина, внутренняя конверсия, диссипация в тепло, фотохимическая реакция или дезактивация за счет тушения флуоресценции при взаимодействии с молекулами тушителя Q.

В действительности квантовый выход флуоресценции меньше единицы вследствие существования в молекуле безызлучательных процессов; следовательно, реальное (или измеряемое) время жизни тау флуоресц окажется меньше тау): 1/сумму констант происходящих процессов (флуоресценция, фотосинтез, интеркомбинационная конверсия в триплетное состояние, диссипация в тепло (внутренняя конверсия), тушение*[Q]). Квантовый выход флуоресценции в этом случае выражается соотношением: фи=константа флуоресценции/сумму констант происходящих процессов, т.е. Фи=константа флуоресценции*время жизни.

В отсутствие тушителя квантовый выход флуоресценции обозначают как фи фл0. Фи фл0/фи фл= 1 + константаq*[Q])/сумму всех констант без тушителя, то, обозначив время жизни в отсутствие тушителя через тау фл0 (не путать с тау0 которая вообще без побочных процессов), получим, что тау фл0 =1/ сумму всех констант без тушителя и (фи фл0/фи фл) – 1 = тау фл0* константаq*[Q]=K[Q]. I=I0/(1+ K[Q]). Последнее уравнение называется соотношением Штерна и Фольмера, а К — константой тушения. Последняя легко определяется экспериментально при измерении интенсивностей флуоресценции различных образцов, отличающихся концентрацией тушителя. Для этого достаточно оценить угловой коэффициент прямой в координатах I без тушителя/(Iс тушителем - 1) и [Q].

Исходя из определения квантового выхода флуоресценции фи=I фл/(I0-Iпрошедшего через объект), с использованием закона Ламберта — Бэра можно установить связь между интенсивностью флуоресценции I и молярным коэффициентом поглощения, а также концентрацией с: I=K*I0*(1-Т)*фи, где I0— интенсивность возбуждающего света, (1 — Т) — величина поглощения, Т — величина пропускания, К — коэффициент пропорциональности, зависящий от способа измерения.

Так как D= - lg Т = эпсилон*с1, где D — оптическая плотность, то I=K*I0*(1-10 в степени -D)*фи. Выражение в скобках можно разложить в ряд при небольших значениях D и ограничиться линейным членом: I примерно=2,3K*I0*эпсилон*cl*фи

Это означает, что при малых оптических плотностях (меньше 0,1-0,2) I пропорциональна концентрации флуоресцирующего вещества и интенсивности возбуждающего света.

Точное измерение интенсивности флуоресценции осложняется целым рядом факторов: реабсорбцией флуоресценции, экранированием возбуждающего света другими молекулами, светорассеянием, гетерогенностью объекта, миграцией энергии, тушением флуоресценции. При комнатной температуре квантовый выход флуоресценции хлорофилла в нативных фотосинтетических мембранах составляет не более 3%. Низкотемпературная техника может ослабить влияние возбуждающего света, вызывающего побочные процессы. Флуоресценция хлорофилла в нативных фотосинтетических мембранах продуцируется молекулами хлорофилла антенны и при комнатной температуре характеризуется главным максимумом 684-687 нм и «плечом» в более длинноволновой области около 720-730 нм. В случае целых листьев из-за реабсорбции доля длинноволновой полосы возрастает. При комнатной температуре квантовый выход для фотосистемы 1 в несколько раз меньше, чем для фотосистемы 2.

Люминесценция — «холодное» свечение некоторых веществ (люминофоров); излучение, представляющее собой избыток над тепловым излучением тела при данной температуре и имеющее длительность, значительно превышающую период световых волн. Характеристики: спектр возбуждения, спектр люминесценции, квантовый выход, время жизни молекулы в возбужденном состоянии. Она делится на уже описанную флуоресценцию (быструю люмин) и фосфоресценцию (медленную люмин). Фосфоресценция – переход с нижнего колебательного уровня триплетного состояния T1 на основное возбужденное (время жизни возбужденного состояния при фосфоресценции составляет порядка 10 в −2 – 10 в −4 с, т.к. синглет-триплетные переходы имеют квантово-механический запрет – так может делать хлорофилл). Механизмы миграции хорошо отражает рис 3 и описанные ранее процессы.

Характеристики

Список файлов вопросов/заданий