Готовые билеты в PDF-формате (1123293), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Следовательно, лишь часть поглощенной энергиирасходуется на возбуждение люминесценции, другая же ее часть идет на увеличение колебательнойэнергии молекул и развитие в них безизлучательных переходов.Обычно правило Стокса не выполняется. Это связано с тем, что у подавляющего числа веществспектры поглощения и люминесценции в той или иной степени перекрываются между собой.Несоответствие правила Стокса многочисленным экспериментальным данным было устранено вболее общей зависимости, установленной Э.Ломмелем. Эта закономерность получила названиезакона Стокса – Ломмеля: спектр флуоресценции всегда смещен в сторону более длинных волн посравнению со спектром поглощения того же вещества: hvabc, макс < hvlm, макс3.
Правило зеркальной симметрии спектров поглощения и люминесценции Левшина.Если по оси х откладывается частота v, по оси у – молекулярный коэффициент поглощения (дляспектра поглощения) и интенсивность излучения (для флуоресценции), то действует правилозеркальной симметрии Левшина: спектры поглощения и флуоресценции приблизительнозеркально симметричны относительно прямой, проходящей перпендикулярно к оси частот черезточку пересечения обоих спектров, если они представлены в шкале частот. Зеркальная симметриянаблюдается у спектров многих сложных веществ, находящихся в кристаллическом состоянии, врастворе, иногда и в разреженных парах.
Правило Левшина не абсолютно. Выполняется для молекулс одинаковой структурой колебательных подуровней основного и возбужденного электронныхсостояний. Данное правило может быть записано в виде:vabc + vlm = 2vо,где vо – частота, соответствующая линии симметрии, проходящей через точку пересечения обоихспектров.Расстояние между положениями максимумов в спектре поглощения и спектре флюоресценцииназывают стоксовым смещением (рис.2).AСтоксовосмещение12спектрспектрпоглощенияфлуоресценцииантистоксоваяобластьIlmλРазличные флуоресцирующие вещества характеризуются неодинаковым стоксовым смещением,поскольку имеют неодинаковые возбужденные электронно-колебательные состояния. Чем большеРис. стоксова2. Спектр поглощенияи спектрвеличинасмещения,(1)темболеефлюоресценциинадежно определение люминесцирующих веществфлуоресцентным(2).
А - методом.светопоглощение, Ilm – интенсивностьмешает возбуждающее излучение, которое можноИзмерениюинтенсивностиIlm флуоресценциилюминесценции,λ – длинаволныустранить если:а) излучение флуоресценции наблюдать в направлении перпендикулярном к направлениюсветового потока возбуждающего излучения;б) отделить спектральный участок возбуждающего излучения от спектрального участкафлуоресцирующего излучения с помощью светофильтров;г) использовать фронтальное измерение – направления возбуждающего светового потока иизлучение флуоресценции направлять под острым углом;д) проводить регистрацию результатов в линию, т.е. когда направления возбуждающего световогопотока и излучения флуоресценции совпадают.4. Закон Вавилова.Закон Вавилова С.И.
гласит: квантовый выход флуоресценции постоянен, если длина волнывозбуждающего света меньше длины волны флуоресценции.φ = const, если λabc < λlm.При λabc > λlm (антистоксова область) квантовый выход резко уменьшается.Из закона Вавилова следует: в определенном спектральном диапазоне (при λabc < λlm) спектрлюминесценции (флуоресценции) не зависит от того, каким участком спектра возбуждаетсялюминесценция (флуоресценция), т.е. спектр люминесценции не зависит от длины волнывозбуждающего излучения.§1.
Определение люминесценции; время жизни.Излучение, избыточное над тепловым, длительность которого намного превышает периодсветовых колебаний, называется люминесценцией. По длительности излучения люминесценцияделится на флуоресценцию (длительностью 10-8-10-9 с) и фосфоресценцию (длительностью 10-6 с иболее).Характеристиками люминесценции являются среднее время жизни, спектры возбуждения иизлучения, квантовый и энергетический выходы и поляризация.Изменение населенности возбужденного уровня молекулы, с которой испускаетсялюминесценция (в данном случае для простоты будем рассматривать флуоресценцию), может бытьописана следующим дифференциальным уравнением:dn= kI − k f n − ki n − k d ndt(4.1)В этом уравнении n — заселенность уровня, k — коэффициент поглощения света, I —интенсивность возбуждающего света, kf — константа скорости флуоресценции, ki — константаскорости внутренней конверсии, kd — константа скорости безизлучательной тепловой деградации.После прекращения возбуждения уравнение (4.1) примет видdn= − k f n − ki n − k d ndt(4.2)−Его решение имеет видτ=tn = n0 e , где1−1= (k f + k i + k d )k f + ki + k dτ(4.3)Поскольку интенсивность флуоресценции пропорциональна n, через время t=τ=(kf+ki+kd)-1интенсивность флуоресценции уменьшится в е раз.
Величина τ называется временем жизни илидлительностью флуоресценции.Время жизни флуоресценции измеряется либо с помощью фазовой флуорометрии, либо спомощью лазерной пикосекундной техники, а время жизни фосфоресценции — с помощьюфосфороскопа.Остановится на методе фазовой флуорометрии. Блок-схема установки для измерениявремени жизни этим методом показана на рис.
11.На рис. 11 обозначения имеют следующий смысл: 1 – источник света для возбужденияфлуоресценции, 2 – модулятор, модулирующий световой поток с круговой частотой ω. Обычно этолибо модулятор на стоячих ультразвуковых волнах, либо ячейка Керре. Частота модуляции обычнобывает около 10 МГц. Модулированный поток через полупрозрачную пластинку 3 и фильтр 4 падаетна образец 5. Излучение флуоресценции и возбуждающий свет попадают на приемники 6 и 7(обычно ФЭУ с подходящей спектральной чувствительностью).
Радиотехническая схема 8вырабатывает сигнал, пропорциональный сдвигу фаз между возбуждающим светом ифлуоресценцией.Пусть исследуемый образец облучают синусоидально-модулированным светом,интенсивность которого может быть описана следующий образом:I (t ) = I 0 (1 + M sin ωt )Величина M описывает глубину модуляции. Излучаемая образцом флуоресценция будетотставать по фазе от возбуждающего света на угол φ, а степень модуляции уменьшится, что мыбудем описывать множителем m. Таким образом, интенсивность люминесценции будет иметь вид:F (t ) = F0 [1 + Mm sin (ωt + ϕ )]Как мы уже указывали, с помощью радиотехнических устройств (обычно фазачувствительных,синхронных детекторов) измеряют фазовый угол φ и фактор демодуляции m. В случаеединственного времени жизни (моноэкспоненциальный спад), эта величина может быть рассчитанапо измеряемым значениям φ и m по следующим формулам:tgϕ = ωτ(m(ω ) = cos ϕ = 1 + ω 2τ 2)− 12В случае, если образец флюоресцирует с несколькими временами жизни флуоресценции,тогда время τ, вычисленное из величины φ не согласуется с величиной τ, определенной по величинефактора демодуляции.
В этом случае возникают более сложные выражения для определения τi:tgϕ =∑ f sin ϕ cos ϕ∑ f cos ϕiii2iii=N (ω )D(ω )i122 2 2m(ω ) = ∑ f i cos ϕ i + ∑ f i sin ϕ i cos ϕ i = i i[]1= D 2 (ω ) + N 2 (ω ) 2fif ωτN (ω ) = ∑ i 2 i 2 ;D(ω ) = ∑;2 2++11ωτiωτiii(4.4)В этих выражениях φ(ω) и m(ω) — фазовый сдвиг и фактор демодуляции, определяемыеэкспериментально; τi — время жизни i-го компонента, fi — доля i-компоненты в общейинтенсивности флуоресценции. Вообще говоря, величины fi и τi могут быть определены изизмерений φ и m при n модулирующих частотах, при этом необходимо вычислить n величин N(ω) иD(ω). Тогда можно написать систему 2n уравнений, из которых определить 2n параметров fi и τi.§2.
Спектры возбуждения и излучения флуоресценции; выход флуоресценции; поляризация.Спектром излучения флуоресценции (спектром флуоресценции) называется зависимостьинтенсивности флуоресценции от длины волны или частоты при постоянной интенсивности и длиневолны возбуждающего света. Спектр флуоресценции описывается зависимостью Iизл=Iизл(λ) приIв=const, λв=const (или νв=const). Длина волны возбуждающего света расположена в пределахспектра поглощения флуоресцирующего вещества; обычно она выбирается равной λmaxОшибка!Закладка не определена., длине волны максимума спектра поглощения. Для регистрации спектрафлуоресценции необходимы: источник возбуждающего света, два монохроматора (для возбужденияи для анализа спектра), фотоприемники для измерения интенсивности возбуждающего света иинтенсивности флуоресценции.Опытным путем установлено, что форма спектра флуоресценции (или нормированный спектрфлуоресценции) не изменяется при изменении длины волны возбуждающего света в пределахполосы поглощения флуоресцирующего вещества.
Это утверждение называется закономС.И. Вавилова. Он верен для одного поглощающего или излучающего вещества.Спектр возбуждения флуоресценции определяет эффективность возбуждающего светаразной длины волны в возбуждении флуоресценции. Спектр возбуждения определяетсясоотношением:F(λ)= Φ( λ )I b (λ)где F(λ) — зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны, Ib(λ) — зависимостьпоглощенного возбуждающего света от длины волны. Обычно при измерениях спектра возбужденияинтенсивность флуоресценции поддерживают постоянной, максимальной F(λ)=Fmax=const.
Тогдаспектр действия (возбуждения) флуоресценции выражается следующим образом:Φ( λ ) =FI (λ)maxbМаксимальную интенсивность флуоресценции поддерживают постоянной, изменяяинтенсивность возбуждающего света. Тогда спектр возбуждения можно построить, откладываявеличину, обратную интенсивности возбуждающего, против соответствующей длины волны.Важной характеристикой является выход флуоресценции. Различают энергетический иквантовый выходы флуоресценции. Энергетическим выходом флуоресценции называетсяотношение интенсивности флуоресценции к интенсивности поглощенного света:ϕexpEE=fladКвантовым выходом флуоресценции называется отношение числа испущенных квантовфлуоресценции к общему числу поглощенных квантов.ϕ=kNNfladСуществуют флуоресцирующие вещества с очень большим квантовым выходом.
Так,флуоресценция 6-аминоакридина в спирте имеет квантовый выход около 0,9. Это значит, что оченьмало поглощенной энергии переходит в тепло; по-видимому, в этом случае мы имеем дело с оченьжесткой молекулой.Весьма важной характеристикой флуоресценции является поляризация. В общем видеполяризация флуоресценции характеризует анизотропию излучающего осциллятора. Она можетбыть описана двумя величинами: поляризацией и анизотропией флуоресценции.F −FF +FP=⇓⊥⇓⊥A=;F −FF +2F⇓⊥⇓⊥В этих формулах F║ и F┴ — интенсивности флуоресценции с компонентами параллельной иперпендикулярной поляризации возбуждающего света. Между P и A существуют следующиесоотношения:A=P02P3− P ;(P=3A2+ AДля неподвижных и хаотически ориентированных молекул поляризация равна)(cos β + 3)= 3 cos β − 122В то же время при возбуждении неполяризованным светом22P0 = 3 cos β − 1 7 − cos β()()βВ этих формулахугол обозначает угол между поглощающим и излучающим диполями.§3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
