Курс лекций в ворде (1121143), страница 14
Текст из файла (страница 14)
2. Уровень транскрипции. Пусть клетки обладают идентичной структурой ДНК, но в некоторых из них активны одни гены, а в других — другие. Тогда они будут осуществлять транскрипцию разных наборов мРНК и дифференцироваться в разных направлениях. В этих случаях мы будем говорить о регуляции дифференцировки на уровне транскрипции.
Клетки эукариот обладают широкими возможностями регуляции активности структурных генов. Для этого у них имеются обширные области ДНК, называемые контролирующими районами. В них различают промоторы — участки ДНК, непосредственно примыкающие к данному структурному гену и связывающие РНК-полимеразу, а также более удаленные и обширные участки ДНК, называемые энхансерами. Один структурный ген может
иметь несколько энхансеров. Это обозначается как многомодульная регуляция. Энхансеры связываются с обширными комплексами белков (так называемыми гетеромультимерами), которые в зависимости от своего состава могут либо усиливать, либо подавлять действие данного структурного гена. Многомодульная регуляция и переход от стимуляции данного структурного гена к его подавлению даже при небольшом изменении состава белкового гетеромультимера способствует разнообразию клеточных дифференцировок, столь характерному для эукариот. Воздействие энхансера на данный структурный ген осуществляется благодаря изгибу расположенного между ними участка ДНК, в результате чего комплекс энхансер-белки устанавливает непосредственный контакт со структурным геном. Изгиб возможен благодаря тому, что при связывании энхансера с белками изменяется структура (происходит деконденсация) всего достаточно обширного участка ДНК, расположенного между энхансером и контролируемым им структурным геном.
К процессам, регулирующим активность генов на уровне транскрипции, относится также метилирование-деметилирование различных участков ДНК по цитозину. Метилирование блокирует, а деметилирование деблокирует активность данных генов. Как правило, в ходе раннего развития зародышей происходит деметилирование ДНК, в результате чего и происходит активация генов. Позже, по ходу дифференцировки, уровень метилирования может снова возрасти, оказаться специфическим для данного типа клеток и способствовать поддержанию устойчивости его дифференцировки.
Другой недавно обнаруженный фактор, влияющий на активность и, возможно, на специфичность транскрипции — размер доменов (петлеобразных участков) ДНК, возникающих при ее прикреплении к ядерному матриксу. Этот размер, как правило, увеличивается по ходу развития.
Первыми результатами в пользу гипотезы дифференциальной активности генов были цитологические данные, показавшие, что способность к синтезу мРНК не распределена равномерно по всей хромосоме, а в ней существуют более и менее синтетически активные участки. Мы уже знакомы с этим на примере хромосом ооцита: синтез мРНК идет там только на выпетлившихся участках «ламповых щеток», а синтез рибосомальной РНК и амплификация генов — на других участках хромосом.
Аналогичные синтетически активные, вздутые участки хромосом (пуфы) обнаружены в ядрах клеток слюнных желез дрозофилы. Мощность и расположение пуфов изменяются под воздействием гормонов. Пуфы, как и «ламповые щетки», представляют собой расплетенные, деконденсированные участки хромосом.
Открытие пуфов явилось исторически первым свидетельством того, что гормоны непосредственно влияют на активность действия генов. Но приведенные выше данные в пользу дифференциальной активности генов являются все же косвенными. Прямыми данными были бы лишь сравнения различных типов дифференцированных клеток по составу молекул только что транскрибированных предшественников мРНК — пре-мРНК. Такие сравнения проводят методом молекулярной гибридизации молекул РНК с комплементарными им ДНК (кДНК), синтезированными на соответствующих молекулах мРНК методами генетической инженерии с использованием обратной транскриптазы — фермента, синтезирующего ДНК по матрице мРНК. Гибридизацию можно проводить как in vitro, в биохимических пробах, содержащих извлеченную из изучаемых клеток фракцию РНК, так и на образцах целых организмов или на гистологических срезах. В последнем случае, если наносить на срез ДНК, меченную каким-либо изотопом, можно получать карты-автографы экспрессии определенных генов. Этот метод получил название гибридизации in situ.
Впервые подробные исследования с применением этого метода были выполнены на яйцеклетке дрозофилы. Установлено, что у зародышей дрозофилы белки, кодированные ранее включенными генами, являются активаторами для последующих групп генов. Так, места экспрессии генов группы gap определяются концентрацией белка bicoid, а места экспрессии генов группы pair-rule — соотношением коцентраций белков, кодированных генами группы gap. При этом используется многомодульная регуляция структурных генов.
Надо, однако, заметить, что такой «прямолинейный» путь активации последующих генов белками, кодированными на ранее работавших генах, является скорее исключением, чем правилом: в яйцеклетке дрозофилы он может действовать благодаря ее синцитиальному строению, допускающему свободную диффузию продуктов. При обычных типах дробления, когда бластомеры с самого начала разгораживаются клеточными мембранами, активация генов осуществляется через посредство трансмембранной сигнализации. Интересно, что даже в яйцеклетке дрозофилы «концентрационный» путь регуляции полос экспрессии, по-видимому, не является единственным. Недавно было обнаружено, что градиент концентрации белка bicoid даже в нормальном развитии (и тем более — в экспериментально измененных условиях) может быть весьма изменчивым, а локализация полос генов группы gap тем не менее весьма точной. Таким образом, должны существовать дополнительные к концентрационным градиентам факторы регуляции, которые пока неизвестны.
В целом участие уровня транскрипции в регуляции клеточной дифференцировки не вызывает сомнений. По-видимому, это один из основных уровней регуляции. Надо только иметь в виду, что дифференциально экспрессируются, как правило, не отдельные гены, а целые группы (блоки) генов. По представлениям некоторых авторов, активность этих блоков («генных сетей», по Кауффману) является самоподдерживающейся.
Будучи один раз активированными, они затем спонтанно поддерживают свою активность на определенном уровне. Этим может быть объяснена высокая устойчивость дифференцированного состояния многих типов клеток.
3. Регуляция в процессе сплайсинга и транспорта мРНК в цитоплазму. Данный уровень регуляции ранее обозначался как посттранскрипционный, поскольку считалось, что он включается лишь после окончания транскрипции. По современным данным, однако, рассматриваемые здесь процессы протекают еще во время самой транскрипции (ко-транскрипционно). Остановимся на двух из них.
— Альтернативный сплайсинг. Как известно, только что транскрибированная молекула мРНК (пре-мРНК) состоит из экзонов и некодирующих «вставок» - интронов. Еще в процессе транскрипции интроны удаляются из новосинтезированной мРНК. Оставшиеся экзоны могут сливаться в различных комбинациях, в результате чего из одной молекулы пре-мРНК может образоваться несколько типов более коротких молекул мРНК, кодирующих различные белки.
Регуляция на уровне альтернативного сплайсинга была показана, например, для первичного транскрипта гена альфа-тропомиозина мыши. Путем различных сшивок он может продуцировать мРНК для гладких скелетных мышц, а также фибробластов и клеток мозга, то есть участвовать в дифференцировке совершенно различных типов клеток. Особенно широко представлен альтернативный сплайсинг у насекомых. В одном (правда, исключительном) случае ген дрозофилы, называемый DSCAM, может кодировать путем сплайсинга 38 ООО различных белков! Альтернативный сплайсинг контролируется макромолекулярным комплексом (так называемой сплайсосомой), состоящей из белков и малых молекул РНК. Некоторые авторы склонны считать данный уровень регуляции едва ли не самым важным.
— Регуляция транспорта мРНК из ядра. Например, у млекопитающих лишь около 5% синтезированной РНК покидает ядро и идет в трансляцию.
4. Уровень трансляции. Даже при одинаковом наборе готовых к трансляции мРНК клетки могут различаться между собой по времени начала (инициации) и по темпу трансляции: иногда трансляция может быть вообще на длительный период времени заблокирована, о чем мы уже знаем на примере зрелой неоплодотворенной яйцеклетки. В этих случаях говорят о регуляции на уровне трансляции.
Устранение блока трансляции после активации яйцеклетки достигается добавлением большого количества адениловых групп на 3-конце молекул мРНК. В дальнейшем по ходу дробления материнская мРНК вступает в трансляцию также не сразу повсеместно, а по определенной пространственно-временной программе. Это характерно, например, для яйцеклеток моллюсков. Фактор, регулирующий скорость трансляции, связан у них с полярной лопастью.
Существенные задержки в начале трансляции уже заготовленных мРНК отмечены также при дифференцировке эритроидных, сперматогенных и других специализированных типов клеток. Известны и обратные примеры: при дифференцировке клеток хрусталика куриного зародыша на 6-е сут. инкубации на 1 молекулу мРНК синтезируется в 5 раз больше соответствующего белка (а-кристаллина), нежели на 19-е сут. развития.
Регуляция на уровне трансляции имеет место в синтезе такой важной биологической молекулы, как гемоглобин. Как известно, каждая молекула гемоглобина состоит из 2 а-глобиновых цепей, 2 бета-глобиновых цепей и 4 относительно небольших молекул гема. Любое отклонение синтеза составных частей гемоглобина от данных соотношений приводит к тяжелым нарушениям.
Правильные количественные соотношения между компонентами гемоглобина регулируются следующим образом. Во-первых, избыток гема ингибирует ключевой фермент, ответственный за его же синтез. Во-вторых, этот же избыток активирует синтез глобинов. Данная активация и осуществляется на уровне трансляции: гем (или его окисленная форма гемин) ингибирует фермент протеинкиназу, который фосфорилирует (и тем самым ингибирует) фактор инициации трансляции глобина. Ингибиция ингибитора означает активацию; таким образом, избыток гема подавляет собственное производство и активирует на уровне трансляции синтез глобина, поддерживая тем самым нормальные соотношения компонентов гемоглобина.
Трансляционная регуляция синтеза гемоглобина имеет еще один аспект. Известно, что в диплоидной клетке имеются 4 активных альфа-глобиновых и только 2 активных бета-глобиновых гема. Если бы каждый ген транскрибировался и транслировался с одинаковой скоростью, то на 1 молекулу бета-глобина приходились бы 2 молекулы а-глобина. Между тем уже отношение концентрации бета:альфа мРНК не 1:2, a 1:1,4, а отношение концентрации самих белков в точности равно 1:1. Совершенно очевидно, что темпы синтеза обоих глобинов регулируются как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Регуляция на последней стадии осуществляется, очевидно, в результате конкуренции обеих мРНК за факторы инициации трансляции.
Недавно был открыт новый способ регуляции на уровне трансляции, основанный на так называемой РНК-интерференции. Он действует в ходе развития круглого червя Caenorhabditis elegans. Для нормального развития этого организма необходимо подавлять деление стволовых клеток на определенных стадиях развития — иначе, например, будут возникать «лишние» клетки покровов тела. Подавление происходит ввиду того, что на требуемых стадиях развития благодаря активности определенных генов и последующему сплайсингу возникают короткие молекулы РНК (размером 22 нуклеотида). Они комплементарны тем молекулам мРНК, которые перед этим были вовлечены в трансляцию. Связывание комплементарных молекул (это и есть РНК-интерференция) приводит к подавлению трансляции, а иногда и к деградации перед этим активных мРНК. РНК-интерференция обнаружена также в эмбриональных стволовых клетках мышей. Имеются указания на возможность РНК-интенференции в половой цитоплазме яйцеклетки насекомых.
5. Посттрансляционный уровень. Наконец, трансляция может состояться, но произойдет задержка (возникнет блок) на уровне дальнейших изменений структуры синтезированной белковой молекулы (отщепление фрагментов, изменение третичной структуры (конфор- мации), образование в ряде случаев четвертичной структуры из нескольких субъединиц, различные химические модификации, например добавление фосфорных или углеводных групп (ацети- лирование, фосфорилирование и гликозилирование)) или же на уровне ее «адресации», т.е. поступления в тот участок (отсек) клетки, где она должна функционировать. Это соответствует регуляции дифференцировки на посттрансляционном уровне.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
