Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Плвзмвгическаи мембрана 87 7 мнн омах, кайм- тогда >тсут- соби- еивая ~ептоэянно вто- ем-то зо ю зо Время, мян Рис. 6-12. Фракция меченого ре- цептора трвнсфсррииа, устойчивая к грилсиву, как функция времени после мечсиия (задача 6-32). Штри- ховой ливией показана начальная скорость погружеиия.
итоз, фаго- твует олоч- :мого; лочке слия- цшеся чему? 6-33 4ечена, .етках ф рсреду через овить рити- веще- тифи- легко с по-' расло-, даль-, пакт-: )'С в; эверхзатем ~ участ- ' енные ! ченые . после ' юреза; овали, льду), ! гервообеих ывала 1.0 й ая й о,о о р 0,4 Ъ 02 й в оя О при 0'С, а инкубация проведена при 37'С в течение 1 ч, анализировали с помощью антител к трансферрину.
Если для реакции использовали интактные клетки, то с антителами связывалось 0,54% меченых белков. Если клетки сначала обрабатывали детергентом, то 1,76% меченых белков оказывались связанными с антителами. А. Почему при обработке трипсином разрушаются меченые рецепто- ры трансферрина (но большая часгь рецепторов не повреждается), если клетки выдерживают на льду? Почему меченые рецепторы становятся устойчивыми к трипсину, когда клетки инкубируют при 37 С? Б. Какая доля всех рецепторов трансферрина находится на поверх- ности клетки после инкубации в течение 1 ч при 37'С? Согласуются ли результаты этих двух экспериментальных подходов? Среднее время, за которое рецепторы трансферрина проходят цикл от поверхности клетки в эндосомы и обратно к поверхности, было определено путем мечения рецепторов на поверхности клетки радиоактивным иодом при 0 С и изучения их дальнейшей судьбы при 37'С.
В различные моменты времени после переноса клеток в условия температуры 37еС образцы разбавляли охлажденной до О" С средой, содержащей трнпсин. Количество радиоактивности в рецепторах трансферрина, устойчивых к трипсину, измеряли после их отделения от других компонентов мембран с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Результаты представлены на рис. 6-12. А. Начальная скорость интернализации (погружения внутрь клетки) меченых рецепторов трансферрина указана штриховой линией. Почему эта скорость снижается со временем? Б. Используя начальную скорость интернализации, оцените долю поверхностных рецепторов, которые попадают внутрь клетки за 1 мин. В.
Какая доля молекул рецептора от всей его популяции попадает внутрь клеток каждую минуту? Г. При той скорости этого процесса, которая была определена (пункт В), рассчитайте, сколько потребуется времени для поступления внутрь клеток такого количества рецепторов, которое эквивалентно всей их популяции. Объясните,почему зто время совпадает со средним временем, за которое рецептор совершает полный цикл от поверхности в составе эндосом внутрь клетки и обратно к ее поверхности.
Д. Сколько времени, в среднем, рецептор трансферрнна находится на поверхности клетки? Холестерол — необходимый компонент плазматической мембраны Однако у людей с очень высоким содержанием его в крови наблюдается склонность к сердечно-сосудистым заболеваниям. Холестерол транспортируется в виде простых эфиров в составе частиц липопротеинов низкой плотности (ЛНП).
Эти частицы связываются со специфическим высокоаффинным рецептором на поверхности клетки, затем через окаймленную ямку попадают внутрь клетки и в конце концов оказываются в лизосомах. Здесь их белковая оболочка разрушается, а эфиры холестерола освобождаются и подвергаются гидролизу. Свободный холестерол выходит в цитоплазму н ингибирует фермент гидроксиметилглутарил-СоА- редуктазу — ключевой фермент в биосинтезе холестерола. Однако у больных с тяжелой гиперхолестеролемией липопротеины низкой 68 Гпааа 6 А СВЯЗЫВАНИЕ к 0,2 сй оо й$ *о О1 3 с к о о я 0 0,2 О,1 0 50 100 ЛНП, мкг/мл 50 100 ЛНП, мкг/мл 5 ПОГЛОЩЕНИЕ " 1,О сй Х о с о о с л с о 05 с о с к я 0 1,0 0,5 О ЕО ЛНП, мкг/мл 50 100 ЛНП.
мкг/мл В РЕГУЛЯЦИЯ 0,4 0,4 „"я л о 0,2 Рае. 6-13. Метаболизм ЛНП в клетках здорового человека и в клетках больных с тяжелыми фор- мами наследственной гиперхолесте- ролемпи (задача 6-33). А. Высоко- аффиппое поверхностное связыва- ние ЛНП клеткой. Б. Поглощение ЛНП клеткой. В. Регуляция синтеза холесгерола с помощью ЛНП. Эа связыванием и поглощением ЛНП клеткой следят, используя ЛНП, меченные ферритипом (контрасти- роваиие для электронной микро- скопии), либо ЛНП, меченные радиоактивным йодом (измерение радиоактивности гамма-счетчи- ком). Связанную па поверхности метку можно извлечь путем отмы- вания отрицательно заряженными полимерами.
Интернализованпая метка при этом пе извлекается. 0 50 100 0 50 \00 ЛНП, мкг/мл ЛНП, мкг/мл плотности не выводятся из крови. В результате в кле~ках синтез холестерола не прекращается, что ведет к избыточному накоплению его в организме.
Метаболизм ЛНП удобно подразделить на три этапа: связывание ЛНП с клеточной поверхностью, поглощение ЛНП клеткой и регуляция внутриклеточного синтеза холестерола прн участии ЛНП.На рис. 6-13 показаны результаты изучения этих процессов на культурах клеток кожи здоровых людей и двух больных наследственной гиперхолестеролемией в тяжелой форме.
А. На рис. 6-13, А сравнивается связывание ЛНП поверхностью клеток здоровых и больных доноров. Почему связывание ЛНП нормальными клетками и клетками больного П достигает насыщения? Как объяснить отсутствие связывания ЛНП клетками больного 1? Б. На рис. 6-13, Б показано, что включение ЛНП в нормальные клетки возрастает с увеличением концентрации ЛНП во внешней среде, достигая плато на уровне, который в пять раз превышает количество ЛНП, связанных на поверхности клетки. Почему ЛНП не проникают в клетки больных 1 н 11? В. На рис.
6-13, В сравнивается зависимость синтеза холестерола от Ппазмвтическая мембрана 68 концентрации ЛНП в клетках здоровых и больных людей. Почему при возрастании концентрации ЛНП во внешней среде синтез холестерола в нормальных клетках подавляется, а в клетках больных не меняется? Г.
Как изменится скорость синтеза холестерола в клетках здорового и больных доноров при инкубации этих клеток со свободным холестеролом? !Свободный холестерол проходит через плазматическую мембрану за счет диффузии.) пез ше- гвакой тии сов аых Таблица 6-7. Распределение рецепторов ЛНП на поверхности клеток больного П, его родителей и здоровых доноров !задача 6-34) гью НП сы- ! гми Количество рецепторов ЛНП В окаймленных ямках Вне окаймленных ямок аые ! ней,: ~ает ! НП от, Здоровый мужчина Здоровая женщина Больной П Отец больного П Мать больного П !95 165 342 444 87 !86 186 10 112 91 6-34 Возвращаясь к экспериментальным данным, приведенным в задаче 6-33, вспомним, как обстоит дело с метаболизмом ЛНП у больного П. Его клетки обладали тем же сродством к ЛНП, что и нормальные, и связывали почти то же количество ЛНП, но это связывание не приводило к поглощению последних.
Такое нарушение можно объяснить двумя способами: 1) рецепторы ЛНП в клетках больного П имеют какой-то дефект в той их части, которая обращена к мембране, так что они не могут проникнуть в клетку, хотя их домены, связывающие ЛНП на поверхности клетки, совершенно нормальны; 2) рецепторы ЛНП клеток больного П нормальны, но в результате мутации, затрагивающей механизм проникновения частиц ЛНП внутрь клеток, рецептор с присоединенной к нему частицей ЛНП не может попасть в клетку. Ддя выяснения причины нарушения было проведено обследование родителей больного П.
Поскольку ген, кодирующий рецептор ЛНП, является аутосомным, каждый из родителей должен был передать один из двух своих генов потомку, больному 11. Его мать страдала умеренно гювышенным содержанием холестерола в крови. При 4 С ее клетки в культуре связывали вдвое меньше ЛНП, чем нормальные клетки; но после нагревания до 37'С связанные частицы ЛНП оказывались внутри клеток так же быстро, как н у здоровых доноров. У отца больного П также была умеренная гиперхолестеролемия, но его клетки при 4'С связывали на 50% больше ЛНП, чем нормальные. При 37*С около половины общего количества метки поглощалось клетками с нормальной скоростью, но другая половина в клетки не попадала. В последующем с помощью электронной микроскопии с использованием частиц ЛНП, меченных ферритином, у всех членов этой семьи исследовали связь между расположением клеточных рецепторов ЛНП и окаймленными ямками.
Результаты исследования представлены в табл. 6-7. А, Почему у матери больного 11 была умеренная гиперхолестеролемия? Какой ген рецептора ЛНП она передала своему сыну? 70 Глава 6 А. ПОГЛОЩЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА Б, Почему у отца больного 11 наблюдалась умеренная гиперхолесте ролемия? Можно ли привести довод в пользу объяснения ! либо 2 (см. выше), опираясь на тот факт, что клетки отца больного 1! оказались не способны поглощать рсе связанные на их поверхности ЛНП? ц о х й а яу о о ц е о 2 а В. Можно ли объяснить гиперхолестеролемию у больного П на основании поведения рецепторов ЛНП на поверхности клеток у его родителей? Г.
Какое нарушение в поглощении ЛНП кле~ками больного П вытекает из анализа данных электронной микроскопии? 0 10 20 30 40 Концентрации ПХ а ереае, ц«М 6-35 Клетки поглощают внеклеточные молекулы с помощью эндо цитоза, опосредуемого рецепторами, либо жидкофазного эндоцитоза. Соотношение эффективностей этих двух путей было исследовано на культуре клеток эпителиальной карциномы; чтобы количественно охарактеризовать эндоцитоз, опосредуемый рецептором, эти клетки инкубировали с фактором роста эпидермиса (ФРЭ).
а для измерения жидкофазного эндоцитоза -с пероксидазой хрена (ПХ). Для анализа поглощения этих соединений использовали ФРЭ, меченный ферритином, в концентрации 40 нМ и ПХ. в котщентрации 20 мкМ, т.е. в 500 раз большей, чем концентрация ФРЭ. После различных периодов инкубапии клетки фиксировали, а затем определяли в них ПХ (по цветной реакции) и наличие ферритина в везикулах. Оказалось, что ФРЭ и ПХ находятся внутри мелких везикул с внутренним радиусом 20 нм, причем везикул с ФРЭ было гораздо больше, чем везикул с ПХ. Скорости поглощения ФРЭ и ПХ клетками оценивали по кривым, представленным на рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
