В.Л. Быков - Цитология и общая гистология (Функциональная морфология клеток и тканей человека) (1120985), страница 5
Текст из файла (страница 5)
При работе тканями их предварительно обрабатывают ферментами для разруюния межклеточных связей и получения клеточных суспензий. Окраска клеток флюоресцируюсцими красителями используется ~я маркировки искомого вещества. Некоторые вещества можно непо,юдственно выявить путем цятохимнческой реакции с избирательно ~язываюпшьсся с ними красителем (например, ДНК с помошью бромн- ~ зтидня). Для маркировки других вешеств клетки обрабатываю.г спе~фическими антэгтелами, с которьцги конъюгированы флюореспируюпе красители.
При атом маркированные антитела связываются с соотгсзвуюшими клеточными антигенами (вешествами) в результате иммуьчитохимической реакции. Проточный цитометр (флоу-цитомеэпр) с высокой скоростью юпускает суспензию окрашенных клеток через узкую капиллярную : убку, освегценную лучом лазера. Уровеиь флюоресценцяи каждой ютки илн ее ядра (соответствуюший содержаншо исследуемого вешес- ко ~ — ~ Фэ - 2б- - 27- тва) последовательно регистрируется с помощью специальных детекторов со скоростью до нескольких десятков тысяч клеток в 1 мин. с построением соответствуюпшх гистограмм (графиков распределения) содержания вещества.
В некоторых случаях через капилляр пропускают неокрашенные клетки (форменные элементы крови) и оценивают распределение их размеров и формы, Клеточная сортировка позволяет выделить клетки с оиредсленпымн маркернмми признаками (илгг их сочетанием) из клеточной суспензии. Процедура реализуется с использованием специального прибора - сартера (клеточного анализатора), работаюшего по принпнпу проточного цитометра. но с возможностью Чюрмирования мелких капель, содержащих отдельные клетки, которые, в зависимости от наличия маркировочного сшнала, сортируются и направляются в различные контейнеры.
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ОГАНОВ, ТКАНЕЙ И КЛЕТОК ПОД ЭЛЕКТРОННЫМ МИКРОСКОПОМ В настоящее время в научных исследованиях и клинической диагностике широкое применение нашли два метода электронной микроскошш - трансмиссианная (просвечивающая) электронная микроскопия и сканирующая [рааправая) электронная микроскопия, использующие соответствующие микроскопы - ТЭМ (ПЭМ) и СЭМ (РЭМ). ТРАНСМИССИОННАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ Траисмиссиониая (просвечивающая) электронная микроскопиял основана на использовании пучка эяеюпранов, излучаемого электронной пугнкай внутри колпины микроскопа в условиях высокого ускорято)пего напряжения (40-100 кВ) и глубокого вакуума (10 4 мм рт.
ст.). Фокусировка пучка осуществляется электромагнитными линзами, игрэющнми роль канденсара, объектива и проектора. После прохождения через изучаемый объект, помещенньпй в колонну н обладающий в различных своих участках неравномерной электрошюй плотностью, пучок электронов направляется на флюорецируюший экран и создает плоскостное изображение объекта, которое фотографируется на пластинку или пленку (рис.
2-4). Рис. 2-4. Схема устройства тренсмнсснонного электронного микроскопа. гучок электронов излучается электронной пушкой (зп), включеющей катод (кА) анод (А), фокусируется электромегнитными линземи конденсоре (КО), объективе ОБ) и проектора (пРО). после прохождения через изучаемый объект (иО) пучок лектронов непревляется нз флюоресцирующий экран (ФЭ), создзвея иэображение бъектз, которое регистрируется не фотоплзстинке или фотопленке (ФП). ТЭМ лает возможность изучения объектов, размеры которых лежат ° лк в пределах разрешения светового микроскопа, так и далеко за ними вплоть до уровня макромолекул). Вго разрешение теоретически дости~ет 0.002 ни, однако практически составляет 0.2-0.5 нм, а для боль.пинства биологических объектов - 1-2 нм.
Увеличение ТЭМ равно 100- ')О тыс. Раз. Высакавальтныи ТЭМ (с ускоряющвм напряжением до 1000 кВ) Оеспечивает более высокую скорость движения электронов, которые ,убже проникают в объект. Этот микроскоп дает очень высокое разрекние и позволяет использовать более толстые срезы (до нескольких пкрометров). Взятие и обработка материала для исследования а трансмиссионном электронном микроскопе Взятие материала длл электронно-микроскопического исследования осушеспциется так же. как и для описанного выше гистологического.
Однако кусочки ткани имеют очень мелкие размеры (обычно 1-2 мм); после извлечения они должны немедленно пол[ешаться в фиксатор во избежание ауталитических изменений и высыхания, Фиксация материала производится чаше всего глутаральдегидом; предпочтительно использование перфузионного метода.
Дополнительная фиксация (постфиксацил) щюизводится четырехокисью осмил, который одновременно окрашивает клеточные структуры. Заливка материала осушестюиется в палимеризуюшиеся синтетические эпоксидные смолы. Резка залитого материала производится на специальном приборе - ультратоме с помошыо стеклянных или алмазных ножей. Толшина получаемых ультратонких срезов составляет 30-50 ни (необходилюсть получения очень тонких срезов обусловлена низкой проникаюшей способностью электронов).
Полутонкие срезы (толщиной 0.5-) мки), обычно изп>товляют на ультратоме перед получением ультратонких срезов. Их окрашивают толуядвновым синим и изучают под светооптическим микроскопом для ориентировки в изучаемом объекте. Поскольку такие препараты по качеству значительно превосходят обычные. полученные путем резки на микротоме залитого в парафин материала.
поэтому их нерелко специально готовят для использования в исследованиях, выполняемых на уровне светового мнкроскопа. Окрашивание (нонтрастирование) срезов выполняют с помопфю солей тлжелых металлов (свшша, осмия, урана и др.), которые в различной степени связываются с отдельными структурными компонентами, придавая им неодинаковую электронную плотность. Окрашенные ультратонкие срезы помешают на металлическую сетку и изучают в ТЭМ. шение СЭМ ниже. чем ТЭМ и составляет около 3-10 нм, его увеличение равно 20 гпыс. раз. Обработка материала для исследования в СЭМ включает еп> фиксацию. высушивание и напыление на его поверхность металлов (золота, паллалия нли лр.).
ЭКР рис. 2-5. Схема устройстве сканирующего электронного микроскопа Пучок злектроноэ, излучаемых электронной пущкой (ЭП), фокусируется электромагнитными линээми конденсорэ (КО) и объективе [ОБ). Он сканирует поеерхность изучэемого обьектэ (ИО) блэгодлря его отклонению рефлектором (ДФ), который получает сигнал от генератора сканирования (ГС). Вторичные электроны [ВЭ), излучаемые поеерхностью ИО, еоспринимэютс» детектором (дт) и фокусируются нэ экране [ЭКР), создэеэя ее трехмерное изобрэжение.
СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ Сканирую[цап (растровая) электронная микроскопия основана на сканировании электронным пучком поверхности изучаемого объекта. что достигается благодаря ега отклонению специальным устройством (дефлехтором). Вторичные электроны, рассеиваемые или излучаемые поверхностью объекта, воспрвнимаются летектором и фокусируются на экране СЭМ, создавая ее трехмерное изображение (рис. 2-5). Разре- 2В- Электронно-микроскопическая цнтотсмия„электронно-микроскопическая иммуноцитохимпл и электронно-микроскопическая авторадиография представляют собой адаптацию соответсзвуюшнх методов, начально разработанных для свезооптической микроскопии, к использованию на электронно-микроскопическом уровне.
Они позволяют выявлять различные вешества и изучать п)юцессы метаболизма на уровне отдельных клеток и их колшонептав. Очевидно, чта зля ль>яю>с. ния продуктов питохимнческих реакгшй и маркеров, используемых в иммуношпохимнческих реакциях, выполняемьгх на электронно-микроскопическом уровне. они должны обладать высокой электронной плотностью. Электронна-микроскопический микрааиализ (рептгепавский микроанаяиз) - метод. обесггечнваюгцяй выявление и каличесзпвеппую оценку содержания различных химических элементов в ультратонких или гистолопгческнх срезах, а также образцах. подготовленных для СЭМ. Основан на боыбардировке объекта узким пучком электронов, которая вызывает излучение им в>паричпых электронов и ренгпгеповских лучей.
Последние улавливаются специальным детектором, козсгрый определяет их спектр, характерный для каждого химическою элемента. Методы замараживаиил-скалываиия и замораживания-скалывания-травлвпия дают возможность изучения внутренней сгрукзуры мембран и поверхности мембранных структур клетки. Метод замораживания-скапывапия основан на быстром замораживании клеток в присутствии криопратектара при температуре жидкого азота (-196'С) и раскалывапии в вакууме с помощью ножа.
На поверхность скола, который часто проходит через гидрофобную середину билипидпого слоя мембран, напыляют платину, оргаггический материал удаляют, а полученный препарат (реплику) изучают под электронным лшкроско лом. Метод замораживания-скалывапия-травления используется для изучения наружной поверхности клезочньгх мембранных структур. В соответствии с этим методом, после бьгсцюго замораживания и раскалывания блока ггронзводится его травление - сушка в вакууме для удаления воды. На протравленную поверхность напыляют платину и полученную реплику изучают под электронным микроскопом.
Глава 3 ЦИТОЛОГИЯ: ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ МОРФОЛОГИЯ КЛЕТКИ ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КЛЕТКИ И ЕЕ КОМПОНЕНТЫ Клеткавтка - элементарная структурная, функциональная и генегпическая единица в составе всех распштельпых и животных организмов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
