С.Г. Инге-Вечтомов - Генетика с основами селекции (1117682), страница 68
Текст из файла (страница 68)
15.1) . При заражении бактериальной клетки двумя фаговыми частицами между их геномами возникают функциональные отношения, аналогичные отношениям между гомологичными хромосомами диплоида (см. гл. 9). При зтом обнаруживается доминирование признаков нормального фага, выражающегося в образовании мелких стерильных:пятен как на штамме В, так и на штамме К12 (2). Таким образом, между различными мутациями гП возможен функциональный тест на аллелизм, На основе функционального теста на аллелизм выяснилось, что покус гП включает два гена: А и В.
В ходе репликации фаговых геномов после инфекции бактериального штамма двумя мутантами гП могут образовываться рекомбинанты дикого типа. Частота появления зтих рекомбинантов пропорциональна расстоянию между мутантными точками в геноме бакгериофага. При попарном исследовании способности к рекомбинации трех различных мутантов гП получаемые значения частот рекомбинации могут быть ис- пользованы для линейного расположения мутаций на основе принципа аддитивности (см. гл. 5). В пределах генов А и В локуса гП картиронано более 2000 мутаций. Легко подсчитать, что если бы С.
Бензер использовал только метод попарных скрещиваний мутантов, то для точной локализации мутаций, сопряженной с их испытанием во всевозможных комбинациях, ему потребовалось бы около 2 млн. скрещиваний. Даже при работе с таким объектом, как бактериофаг, подобная перспектива выглядит удручающе. Общее количество необходимых скрещиваний удалось резко сократить благодаря методу лерекрываюи)ихся делейий. Среди мутантов, исследованных С. Бензером, большинство было способно ренертировать к дикому типу, однако встречались и стабильные мутанты. Они же не могли образовывать рекомбинантов при скрещивании с несколькими мутантами, рекомбинировавшими друг с другом.
С. Бензер решил, что такие «стабильные» мутанты возникли в результате выпадения целых участков локуса гП. Спранедлиность этого вьпюда была подтнерждена сначала данными рекомбинационного анализа: стабильные мутации (делеции), введенные в скрещнвание, сокращали генетические расстояния между фланкирующими мутациями, т. е. расположенными справа и слева от делеций. В дальнейшем выпадение участка ДНК продемонстрировали на гетеродуплексах, полученных путем гибридизации ДНК из фага дикого типа и из делеционного мутанта.
При этом в участке, соответствующем делеции гП, образовывалась однонитевая петля за счет «лишней» ДНК из дикого типа, хорошо различимая в электронный микроскоп. Использование делеций при картировании позволяет заменить количественный учет частоты рекомбинации качественным тестом. При скрещивании точкового и делеционного мутантов рекомбинанты могут пояниться, только если делеция не перекрывает участок, в котором локализована точковая мутация.
С. Бензер сначала картировал концы делецнй гП по отношению к некоторым точковым мутациям, а затем использовал набор делеционных мутантов дчя предварительной грубой локализации всех вновь получаемых мутаций гП в том или ином нз 47 сегментов участка гП (рис. 15.4). В дальнейшем взаимное положение мутаций, оказавшихся в одном сегменте, определяли попарными скрещиваниями.
В локусе гП удалось выявить 308 мутационных точек, или сайтов, расположенных в линейной последовательности (рнс. 15.4). На карте ген А занимает участок примерно в 2 раза больше, чем ген В. Отдельные точки локуса гП обладают различной мутабильностью. Наиболее мутабнльные из ннх получили наименование горячих точек. Одна горячая точка в гене В насчитывает 500 спонтанных мутаций. В гене А также имеется одна горячая точка спонтанной мутабильности, насчитывающая около 250 мутаций. При нндуциронанном мутагенезе в локусе гП горячие точки распределяются характерно для каждого использованного мута37б Рис. 15.4. Перекрывающиеся делеции, концы которых картируются в докусе гп (цо С. Бендеру, 19бе).
Проекции «онцоа этих делеций делят локус гп на 47 участков, которые в свою очередь раэбитм на 7 более крупных участков делениями, орсдставленными в ырхнсй части рисунка. Дальнейшие обьжнениа в тексте гена„ отлично от распределения, характерного для спонтанного мутирования. В экспериментах С. Бензера была сопоставлена размерность генетической карты бактериофага (частоты рекомбинации) с размерностью молекулярных структур, ответственных за хранение и передачу наследственной информации, т. е.
с числом нуклеотидных пар молекулы ДНК. При этом за основу были приняты следующие данные. Как показали А. Херши и М. Чейз (см. гл. б), при фагоаой инфекции в бактериальную клетку проникает почти чистая ДНК. Общее число пар нуклеотидов в ДНК фага Т4 составляет 1,8 10"'. Общая длина рекомбинационной карты Т4 равна 1500 ю Минимальная частота рекомбинации в опытах С. Бензера составляла 0,02 г,' (при пределе разрешающей способности рекомбинационного анализа 0,0001 %). Это соответствует приблизительно 1,3 10"' от всего генома Т4 (0,02:1500 = 1,3)( :и а о -( % в Ч й Я ч 41 % о '% б Р М а ~„Л Ъ, ,~„в ~М ~Ф 4 ,~. ч Ч з~в Ф' нвл Х о Е а Е о Ф ъ о ь О.
Ф~ $Ц а~ 4~ Л Ю ' о Х 10 '). Таким образом, можно показать, что с минимальной частотой рекомбинация происходила на расстоянии около двух нуклеотидных пар (1,8 ° 10 п.н. ° 1,3. 10 ' = 2,34). В данном случае важна не столько конкретная цифра, полученная С. Бензером, сколько порядок величины — несколько нуклеотидов. В дальнейшем было показано, что рекомбинация может разделять соседние нуклеотидные пары. Проведя аналогичные расчеты, С. Бензер показал, что и минимальный участок, изменяющийся в результате мутации, измеряется немногими нуклеотидами. Сейчас очевидно, что рекомбинация может разделять соседние пары нуклеотидов, что наименьший участок ДНК, который изменяется при мутировании, — это пара нуклеотидов. По-видимому, по этой причине термины, введенные С. Бензером для обозначения единицы мутации (мутон) и единицы рекомбинации (реном), не получили широкого распространения.
С. Бензер попытался ревизовать и понятие «ген». Для отнесения двух мутаций к одной или разным единицам функции он предложил использовать так называемый цис-транс-тест, изобретенный Е. Льюисом. Согласно этому тесту мутации попарно испытывают в гетерозиготе в двух конфигурациях: цис — когда обе мутации в гибриде происходят от одного родителя, и транс— когда они поступают в гибрид от разных родителей (рис. 15.6). Согласно С. Бензеру, если цис- и транс-гетерозигота имеют одинаковый (дикий) фенотип, то мутации затрагивают разные единицы функций, а если цис- и транс-гетерозиготы разного фенотипа (цис — дикий, а транс — мутантный), то мутации затрагивают одну единицу функции, которую он предложил называть цистроном.
Сравнение рис. 15.1 и 15.6 убеждает в том, что для рецессивных мутаций цис-транс-тест сводится к функциональному тесту Рис. !5.6. Схема цис-транс-теста. Крестики — мутаини на аллелизм Т. Х. Моргана и таким образом понятия цистрон и ген как единица функции совпадают. Несомненным достижением в работе С. Бензера была разработка мегоди лерекрывающи гол делейий для внутригенного картирования, благодаря которому стало возможным «насыщать» генетическую карту мутациями.
Он впервые перевел величины, измеряемые в генетическом анализе, в молекулярную размерность: сопоставил их с мономерами молекулы ДНК. Итогом этой работы было разрешение кажущихся противоречий между критериями аллелизма. Става очевидной их относительность, особенно в отношении рекомбинационного критерия аллелизма. Функциональный же критерий аллелизма сохраняет свою ценность с учетом возможности межаллельной комплементации (см. гл. 2), т. е. он также относителен и в строгом смысле должен применяться на достаточно большом статистическом материале. В дальнейшем будет показано, что относительность функционального критерия аллелизма выражается не только в случае комплементарности аллельных мутаций, но и в случае некомплементарности мутаций разных генов в оперонах (см.
гл. 16). Таким образом, от моргановских представлений об однозначном соответствии результатов разных тестов (рекомбинационного и функционального) на аллелизм мы приходим к пониманию их относительности и необходимости комплексного применения. 15.4. Матричные процессы и действие гена Воспроизведение и действие генов непосредственно связаны с матричными процессами, синтезом макромолекул — ДНК, РНК, белков. Уже рассматривалась репликация (в гл. 6) как процесс, ответственный за воспроизведение генетической информации. Обращаясь к действию гена, рассмотрим транскрипцию или синтез РНК, и трансляцию, или синтез белка.
Именно в этих процессах и реализуется генетическая информация. Поэтому современная теория гена — детище молекулярной генетики — всецело опирается на успехи биохимии, достигнутые в изучении матричных процессов. С другой стороны, метод генетического анализа вносит существенный вклад в изучение матричных процессов, которые, так же, как и ступенчатые процессы, сами находятся под генетическим контролем (рис. 15.7). Согласно схеме рис. 15.7 гены группы ! контролируют через этапы транскрипции и трансляции структуру белков, участвующих в метаболических процессах. Гены группы П вЂ” это гены, ответственные за все матричные процессы.
Они подразделены на две подгруппы Па и Пб. Гены подгруппы Па отвечают за синтез рибосомных и транспортных РНК, которые «обслуживают» процесс трансляции. Гены подгруппы Пб, так же, как и гены группы 1, контролируют структуру белков, но эти белки-ферменты и структурные белки «обслуживают» матричные процессы, т. е. процессы 380 Ва воспроизведения (репликация) и реалнзацин генетической | ф информации (транскрипция и трансляция) .
Схема рис. 15.7 х = личную роль генов 1 и П группы. Гены а к м П группы — фактор + к м интеграции генотипа, контролирующий вос- 3 произведение и экс- Э "и прессию всех ге- ,6 нов клетки. С этой е нх ролью связаны и особенности проявс ления их мутацион- Х ных изменений. Мурке. !як схема реализации генетической ннформн- тационное блокироцнн в клетке. ванне того или иного А, В, С вЂ” промежуточные прохуктм а метаболической Пепи этапа в цепи биосинтеза легко компенсируется добавкой извне недостающего метаболнта. Мутационные дефекты генов П группы компенсировать какими-либо метаболитами невозможно.
Кроме того, эти мутации должны иметь несравненно более широкий плейотропный эффект, нежели мутации генов 1 группы, поскольку они будут сказываться на «оспроизведении или действии всех генов клетки. С такой особенностью связаны и специфические подходы к изучению генов П группы. Прежде всего — это получение мутаций с условным проявлением (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
