С.Г. Инге-Вечтомов - Генетика с основами селекции (1117682), страница 101
Текст из файла (страница 101)
Керкис. Рассматривая различные мутагенные факторы окружающей среды, следует принять во внимание, что они действуют не только 530 2!.2. Тест-системы и система тестов генетической активности Обилие химических соединений, которые цо мере их появления необходимо проверять на генетическую активность, обусловило разработку простых, надежных и децн агах ме'годов и гесгсистем для скриггинггь нли просе. кани», большого числа соединений. Для выявления мутагснов. в этих тест-системах используются различные объектгл и различные критерии.
В настоящее время генетическая активность вещестн определяется по слсдуюц!им основным критериям: !) генным мутациям — заменам, вставкам и выпадениям пар нуклеотидов; 2) конверсии и 3) реципрокной, преимущественно мнтотнческон, рекомбинации; 4) нерасхождению хромосом в митозх", 5) хромосомным аберрациям; 6) обменам между сестринскими хроматидамн.
Кроме того, применяют такие критерии, как увеличение чцс|огы домин штных деталей у дро юфнлы и мышей н частота аномальных сперматозоидов у лпяшсй. Носгнлнис дво тестц нельзя стр;п.о отнести к генетическим, однако их результаты хорошо коррелирунп с остальными тестами, основанными нц критериях повреждения генетического материала. В качестве объектов при массовом определении генетической активности тех или иных факторов используют культуры клеток человека и животных, высшие растения, микроорганизмы, В. те)л лояаягег. тест-системы для быстрой оценки генетической активности хнмнческмх вмдннвннй Обвакты Учнгыаааммй в44мкт !.
Бяктврнн Я. гурlнвнмчнт Е. сой 2. Грибы яаггЛ. гага«шаг Ясйаь рянйе Ягр. пмнйнм Ревврснн Нм — НЬ Устойчивость Лхв." — Лхв' Индувцня профвгв Х Мутации: роверснн вуксотрофных мутантов, «нвзвконное» спаривание цмо мнтохондрнвльные мутации ровврснн вуксотрофных мутантов мутвпнн по бносянтозу метнонннв Рвхомбннацня: мнтотнческвв вонвврсня, мнтотнческнй кроссннговвр загса.
гвггг!Иаг по отдельности, но и во взаимодействии. Так, упомянутый уже природный яд афлатоксин дает мутагенный эффект в результате метаболической активации в организме человека или после воздействия на него солнечного света. Таким образом, постоянное внимание генетической токсикологии, которую можно назвать службой генетической безопасности, должно быть обращено на существование и возможность появления новых физических, химических и биологических факторов, обладающих генетической активностью. Азр. щниlащ босса. сегеытиее Азр.
щни)егл 3. Высщие растения Традесканция набы 4. ))г. ще1алодщ)ег 5. Культура кееток млекопитающих Генатоцнты крыс и др. Человек — Не).а Лимфоциты человека митотический кроссннговер Анеунлаидив и хромасомные перестройки: нерасхоидение хромосом в мнтозе у анеуцлаидав (учет но рецессивным селективным маркерам) делеции и потери ц! хромосомм (система: о )С а ) аатери хромосом е митазе у динлоидов уу+ хромасомные аберрации в кончиках корня Соматические мутации: мозаичность крыльев и глаз Одяоценачечные разрывы ДНК Внеплановый синтез ДНК Цитогенетическне аффекты: хромосомные аберрации, обмены сестринских хроматнд Генные мутации устойчивости Тесты с использованием микроорганизмов отличаются большой пропускной способностью и чувствительностью к мутагенным воздействиям.
Они позволяют в полной мере использовать преимущества селективных методов. Однако главная проблема при применении этих тестов — возможность экстраполяции получаемых результатов на человека. Проверка большого количества соединений на мутагенную активность с использованием млекопитающих, например мышей, не возможна по причине громоздкости и высокой стоимости экспериментов. Решение проблемы было достигнуто при использовании теста на ,иутаргиную активность„опосредованную метаболической системой псчника.
В первоначальном варианте этого теста потенциальные ьсутагены вводили в организм мышей или крыс, в перитонеальную полость которых помещали тест-микроорганизм: бактерии, дрожжи. хамидии нейроспоры, у которых затем учитывали мутации под влиянием ыутлгенов, активированных ферментами животных. В дальнейшем мута)енез, опосредованный метаболической систезой ха)нина, был упрощен и стал проводиться )и т))го. Для этого мут:шеи наносят на чашки Петри, засеянные тест-объектом, н смеси с ферментами микросомной фракции клеток печени мыши или крьн ы.
В этой фракции, обозначаемой В9, находится цигохром р,-, главная функция которого в организме — детоксикация 15 кс)х.дньц соединений. Действуя иа некоторые так называемые ИГ ги) ГагСЧ~Ы. ГИСтеыа )ИИКРОСОМНОГО ОКИСЛЕНИЯ ПРЕВРашаст ИХ В м) та Гене). В системах с метаболической активацией промутагенов используют не только микросомную фракцию печени, но и кровь или мочу животных и человека, а также экстракты из тканей высших растений.
Благодаря использованию детально разработанных мутацион- 532 ных систем у микроорганизмов открываются большие возможности не только для тестирования мутагенной активности различных соединений, но и для выяснения механизма их действия, При этом используют мутантов с генетическими изменениями определенной молекулярной природы. Так, широкое применение нашла тест-система, разработанная Б.
Эймсом на основе НВ- мутантов $. Гурйутипит. Он использует несколько мутантов типа замены пар оснований, а также типа вставок-выпадений пар оснований ло гисгидиновому олерону. Мутации объединяются с делецией по одному из генов, контролирующих эксцизнонную репарацию, что повышает чувстительность теста в несколько сот раз. В геном тех же штаммов введена мутация, блокирующая образование липополисахаридной капсулы бактерий, благодаря чему повышается проницаемость клеток. В клетки введены также плазмиды — В-факторы, которые способствуют выявлению мутаций, возникающих как ошибки рекомбинации. Мутагенный эффект испытываемых соединений определяется в так называемом слог-гесге, для чего на чашки Петри без гнстидина, засеянные тест-штаммом, наносится исследуемое вещество вместе с микросомной фракцией гомогената печени мыши для активации мутагенов.
Появление Н)з"-ревертантов свидетельствует о генетической активности испытываемого агента. Благодаря использованию этой системы показана тесная корреляция мутагенной активности и канцерогенности многих соединений, т. е. выявление генетической активности соединения одновременно с большой вероятностью указывает на то, что оно потенциальный канцероген. Б. Эймз показал мутагенную активность ряда веществ, применяемых в качестве консервантов пищи, ряда красителей для волос, сигаретного пепла, грибных токсинов (в частности, афлатоксинов), бена(а)пирена и др.
В дальнейшем подход, разработанный Б. Эймзом, нашел применение и в работе с другими микроорганизмами: бактериями, дрожжами (рис. 2!.1). При изучении мутагенеза под действием факторов, загрязняющих окружающую среду, необходимо испытывать сложные смеси веществ, включающих органические и неорганические молекулы. Кроме того, даже зная химическую структуру соединения, трудно предсказать характер его мутагенной активности. Поэтому для испытаний предложено использовать набор штаммов одного и того же микроорганизма, несущих мутации известной молекулярной природы и специфически реагирующих на действие эталонных мутагенов, Среди таких мутагенов, применяемых в эксперименте в качестве обязательного позитивного контроля, используются ультрафиолетовый свет, этилметансульфонаг, нигроэосоединенин, й-пропиолакгон.
б-гидроксиламинопурин и т. д. В таких тестах выявление мутагенной активности загрязнителей окружающей среды позволяет грубо оценивать механизм действия активного начала. Кроме того, применение серии штаммов с различной локализацией мутаций позволяет минимизировать «эффект контекста«на 533 Рис. 2КЬ демонстрации генетической активности химических соединений и лова>.
А — реверсии НЫ' . НМГ Яа!аюлейа ГурИтигГиаь Спет-тест Б. Эймта: а центре кружок фильтровальной бумаги, смо миной мутагеноуе, раствореннмм смесь, содержапгую микросомную фракцию печени жнвотнвх 4 — ДМСО- «оатроль без мутагеаа, 2 — ДМСО+ К-метил-К'-витра-К-иитроюгу» мылив) бса хобхактор~эе, 4 — то же, что иа чамке К ко с и — реверсии Асг» -» Аост у дрож ! — контроль, 2 — оод действием ультрафиолетового авета Г75 Дм/мхь 3 — К-ветре мутагенез. Известно, что мутации одинаковой природы происходят с неодинаковой частотой в разных участках даже одного и того же гена.
Наряду с прокариотическими микроорганизмами (бактерии) в тест-системах часто используют эукариотические микроорганизмы — грибы: дрожжи Ъассл. сегертае, усттгх. ротгге, нейроспору и аспергилл, в меньшей степени — водоросли и простейших. У дрожжей, так же как н у бактерий, учитывают прямые и обратные генные мутации, применяют метаболическую активацию, а кроме того, дрожжи сами активируют многие промутагены.
В дополнение к этому у дрожжей исследуют внутригенную рекомбинацию (конверсию) н реципрокную рекомбинацию в митозе. На 534 л /~ ультрафиолетового света в тест-системах с микроорганизмами (фото Ю. И. Павчашки без гистндииа засевают культурой ТА(00 5.
(урйпнинпт и помещают в диметилсульфоксиде (ДМСО). При необходимости добавляют активируюшую (мышей, крыс, кур и т. д) с необходимыми кофакторами: индии, у — дМСО + 2-анянофяупрен + невелнзя «ктнвнрующая смесь (нз печени добавлением кофакторо» -- полная актиеярующая смесь. щей басей. сггеиипе, штамм р2009. земетнлмечевннм (спот-тест), ч — Н-нетил-М-негро-И-нятрозогуаннднна (спот-тест) основе генетических критериев у этого объекта учитывают также хромосомные аберрации — потерю плеча или всей Ш хромосомы, а также нерасхождение хромосом. Последний эффект удобнее исследовать у аспергилла, для которого хорошо разработаны методы анализа нерасхождения хромосом, приводящие к гаплоидизации в парасексуальном цикле (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
