Изучение взаимодействия белка Est3, компонента теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces сerevisiae с G-квадруплексами (1110896), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Рис. 2 Различные виды G-квадруплексов

разному может располагаться в полученном квадруплексе. Как видно на рисунке, одноцепочечная ДНК может располагаться параллельно друг другу (a); иметь вид двух параллельных друг другу «петель» (б); двух диагональных и противонаправленных петель по диагоналям (в); унимолекулярный G-квадруплекс, где одноцепочечная ДНК располагается в виде диагональной петли (г).

Имеются данные о том, что довольно большое количество G-квадруплексов содержится в раковых клетках. Также известно, что в раковых клетках активна теломераза. В связи с этим можно выдвинуть предположение, что G-квадруплекс имеет прямое отношение к работе фермента теломераза и что разрушение G-квадруплекса, возможно, будет способствовать ингибированию теломеразы. Возможно, что агент, стабилизирующий G-квадруплексы, будет использоваться в лекарствах против рака, направленных на ингибирование теломеразы.

G-квадруплексы в теломере

На сегодняшний день нет четких доказательств того, что теломерные повторы дрожжей образуют G-квадруплексы in vivo, однако есть многочисленные косвенные факты, указывающие на то, что все-таки данные структуры образуются.

Например, на сегодняшний день известно множество белков, способных связываться с G-квадруплексами, формировать или разрушать данные структуры []. Также, известны нуклеазы, специфично разрезающие ДНК внутри или около квадруплексов. А так как наибольшая концентрация остатков гуанозина наблюдается только в таких объектах как теломеры, промоторы некоторых генов и участки, подверженные частой рекомбинации, то можно предположить формирование G-квадруплексов для теломерных участков. Образование квадруплексов в теломерных областях ДНК было показано in vivo для человека и простейших.

Многие низкомолекулярные ароматические соединения стабилизируют G-квадруплексы как in vivo (для человека), так и in vitro. Притом, in vivo это приводит к ингибированию удлинения теломер в раковых клетках. На этом основано действие разрабатываемых по сегодняшний день противораковых препаратов.

Опубликована статья [15], в которой показано формирование G-квадруплексов в генетическом материале инфузорий in vivo. Авторами работы были получены антитела, способные связываться с антипараллейльными ДНК G-квадруплексами. При этом такие антитела взаимодействовали с макронуклеусом Stylonychia lemnae.

Было подтверждено также и образование G-квадруплексов in vivo у человека [16-18], для чего использовался особый краситель, который дает разные спектры испускания при связывнии с различным субстратом – ДНК-дуплексом или ДНК G-квадруплексом (545 и 575 нм соответственно). Сравнение спектров флуоресценции показало, что квадруплексы действительно существуют на концах хромосом.

Участие TERRA в работе теломеразы

Н

3

е смотря на то, что теломеры являются гетерохромосомной структурой, недавние исследования показали, что эукариотическая теломера все же подвергается процессу транскрипции при помощи ДНК-зависимой полимеразы PolII. Итогом этого процесса выступает молекула TERRA (TElomeric Repeat-containing RNA), содержащая теломерные повторы. TERRA транскрибируется с нескольких, может быть всех, хромосомных концов комплементарной цепи, начиная с субтеломерной области в направлении концов хромосом. Ядерная локализация TERRA и ее ассоциированность с теломерами указывает на то, что TERRA не транслируется, но при этом выполняет какую-то роль в теломерных гетерохроматиновых структурах. Достоверно известно, что TERRA в определенных обстоятельствах мешает процессу полуконсервативной репликации теломерной ДНК. Однако, транскрипция TERRA с теломерной ДНК может глобально регулировать работу фермента теломераза, а, следовательно, длину индивидуальных теломер на хромосомах, поскольку TERRA оказывает ингибирующее воздействие на теломеразу. Возможно, это обстоятельство как-то связано с тем, что в клетке в среднем удлиняются теломеры, которые короче чем ближайшие соседи в пределах одной клетки.Как известно, теломеры сами по себе образуют различные структуры (t-петли, G-квадруплексы), которые активно мешают процессу репликации. Известно также, что в субтеломерных областях существуют области, богатые С (CpG strands). С этими областями TERRA может связываться и закрепляться на хромосоме. Далее TERRA, предположительно, образует межмолекулярные G-квадруплексы с теломерной ДНК, что отрицательно сказывается на процессе репликации. Действительно TERRA накапливается в ранней G1-фазе и ее концентрация падает к S-фазе, а самый минимум концентрации TERRA приходится на период от S-фазы до G2-фазы [10]. Известно также, что хеликаза UPF1 также регулирует распространенность TERRA [11] (в местном масштабе хеликаза UPF1 может разлагать TERRA для нормальной работы репликационной вилки). Таким образом избегается нежелательный отжиг TERRA к одноцепочечной теломернной ДНК.

Вся человеческая и в большинстве своем дрожжевая TERRA на 5’ конце кэпирована 7-мелилгуанозином. Это показывает, что 5’ концы TERRA определяются местом начала транскрипции и посттранскрипционной модификации не происходит (например, отрезания 5’ конца РНК). 3’ конец TERRA редко бывает полиаденилированным, но все же хвосты polyA влияют на стабильность TERRA. Так, например, PolyA-TERRA имеет период полураспада около 3 часов, тогда как PolyA+TERRA – более 8 часов.

Результаты и обсуждение

Постановка задачи

Белок Est2 вместе с теломеразной РНК образует так называемый коровый фермент, достаточный для работы теломеразы in vitro, однако in vivo для работы теломеразного комплекса исследуемых дрожжекй необходимы такие белки как Est1 и Est3. Функции белка Est3 до сих пор остаются не совсем понятными.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что белок Est3 взаимодействует с ДНК G-квадруплексами. Было высказано предположение, что данная функция белка необходима для работы теломеразного комплекса.

Подтверждение сенессенс фенотипа штамма дрожжей с мутантной формой белка Est3D164A

Мутантная форма Est3D164A представляет собой белок Est3, у которого сохранено взаимодействие с остальными компонентами теломеразного комплекса, при том, что работа самого комплекса нарушается. Сам по себе белок Est3D164A получен заменой 164 аспарагиновой кислоты на аланин. Штамм с заменой гена на хромосоме был получен ранее в нашей лаборатории.

Была получена серия чашек Петри с колониями дрожжей, посаженными в капле среды, концентрация которой менялась последовательными разведениями. Предварительно, клетки растили в течении от 10 до 100 поколений после замены гена Est3 на хромосоме. Ниже показана чашка Петри (рисунок слева) с клетками, которые предварительно растили в жидкой среде в течении 30 поколений (менее 50 поколений, то есть до наступления сенессенса). Колонии клеток в последовательных разведениях выглядят одинаково для всех штаммов. Рядом (рисунок справа) показана чашка Петри с клетками, которые предварительно растили в жидкой среде в течении 70 поколений с того же момента (более 50 поколений, то есть после наступления сенессенса).

Рис. 4 Фенотип полученных штаммов, экспрессирующих мутантный Est3. Серия разбавлений равного количества клеток разных штаммов была высеяна на чашки Петри со средой YPD. Рисунок слева - до наступления сенессенса. рисунок справа - после наступления сенессаенса

Таким образом дрожжи, в которых ген белка дикого типа заменен на ген, несущий мутации и приводящий к экспрессии белка Est3, проявляют сенессенс фенотип, что подтверждает важность этой аминокислоты для нормальной работы теломеразного комплекса in vivo.

Выделение белка Est3

Первым этапом работы было выделение белка Est3. Для этого клетки E.coli были трансформированы экспрессионными плазмидами, содержащими ген полноразмерной формы белка Est3, и содержащего дополнительную последовательность из 6 гистидинов на C-конце для возможности выделения данных белков методами афинной хроматографии. Также, в обоих плазмидах присутствовал ген His3MX6, с помощью которого клетка может выжить в среде без гистидина.

Клетки растили в среде LB до OD₆₀₀=0,4-0,6, индуцировали 24 мкл IPTG и растили 14 часов при 16°C. Выделение белков проводилось методами афинной хромотографии на Ni-сефарозе. В результате был выделен белок Est3.

Выделение и формирование РНК и ДНК G-квадруплексов

Для достижения данной задачи использовали ДНК и РНК олигонуклеотиды, образованные четырьмя теломерными повторами а также нетоломерный ДНК олигонуклеотид. Формировнаие G-квадруплексов проводили двумя различными методами. По первой методике олигонуклеотиды упаривали в 200мМ ацетате аммония, при этом предположительно образовывались межмолекулярные квадруплексы. По второй методике олигонуклеотиды упаривали в 200мМ хлориде калия, при этом предположительно образовывались мономолекулярные квадруплексы.

Общие положения по выполнению эксперимента для определения констант взаимодействия белка Est3 дикого и мутантного типа с G-квадруплексами

Константы вазимодействия Est3 с квадруплексами определялись титрованием меченых на 5’-конце флуоресцеином квадруплексов белком Est3. Измерение проводилось с помощью автоматизированной рабочей станции Janus фирмы Perkin Elmer. В 8 ячеек в одном столбце 96-луочной планшеты для измерения флуоресценции добавлялось по 40 мкл квадруплекса или одноцепочечной ДНК с концентрацией 1 μМ в буфере Б-100 без глицерина. Затем к образцам добавлялось одинаковое количество белка в буфере Б-100 образцы инкубировались при 30˚С при перемешивании в течение 45 секунд. После этого планшет переносился в интегрированный прибор для измерения анизотропии флуоресценции Victor3000 фирмы Perkin Elmer. В данной работе также используются следующие обозначения: NH₄⁺ - квадруплексы, полученные упариванием в 200мМ ацетате аммония, K⁺ - квадруплексы, полученные упариванием в 200мМ хлориде калия, буквы Д или Р соответственно для обозначения ДНК и РНК олигонуклеотидов, цифра после заглавной буквы Д или Р обозначает количество теломерных повторов (в нашем случае - 4)

Доказательство специфичности взаимодействия белка Est3 дикого типа с G-квадруплексами

Для доказательства специфичности взаимодействия Est3 с G-квадруплексами проводили измерения анизотропии флуоресценции в различных случаях. В первой серии опытов белок Est3 взаимодействовал с Д4 NH₄⁺ квадруплексом (1). Во второй серии опытов проводили взаимодействие с одноцепочечным олигонуклеотидом Д4 (2). В третьей серии опытов проводили взаимодействие с нетеломерным олигонуклеотидом (3). Ниже представлен график, полученный при обработке выходных данных. Как видно, взаимодействие наблюдается только для G-квадруплекса, при этом константа диссоциации комплекса равна 1,4 мкМ. Взаимодействия в двух других случаях не наблюдалось. Тем самым доказали специфичность взаимодействия с квадруплексами.

1

2

3

Сравнение взаимодействия белка Est3 с различными типами G-квадруплексов

Провели измерения для теломерных Д4 олигонуклеотидов, полученных упариванием в ацетате аммония (предположительно межмолекулярный квадруплекс) и упариванием в хлориде калия (предположительно мономолекулярный квадруплекс). Оказалось, что взаимодействие лучше для межмолекулярного квадруплекса. Квадруплекс, полученный упариванием в хлориде калия более стабилен, чем в случае упаривания в ацетате аммония, и возможно, что в процессе взаимодействия меняется конформация квадруплексов.

Д4 NH4+

Д4 K+

Сравнение дикого и мутантного типа белка Est3

Для выяснения, приводит ли отсутствие взаимодействия Est3 с ДНК G-квадруплексами к нарушению работы теломеразы, был выбран мутантный аналог Est3D164A, экспресированный по гену Est3 приводящим к изменению последовательности белка с заменой 164 аспарагиновой кислоты на аланин. Оказалось, что белок дикого типа взаимодействует лучше, чем белок мутантного типа. Увеличение константы диссоциации в 3 раза для мутантной форсы может быть одной из причин нарушения работы теломеразы. Недавно было показано, что Est1 способен сворачивать ДНК-квадруплесы. Таким образом, логичным является предположение, что Est3 связывается и стабилизирует G-квадруплексы, образованные Est1 для нормальной работы теломеразы.

Характеристики

Список файлов курсовой работы