Изучение взаимодействия белка Est3, компонента теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces сerevisiae с G-квадруплексами (1110896)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова

Химический факультет

Кафедра химии природных соединений

Лаборатория химии нуклеопротеидов

Тема: Изучение взаимодействия белка Est3, компонента теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces сerevisiae с G-квадруплексами.

Курсовая работа по биохимии
студента 110 группы
Дихтяр Ю.Ю.

Научный руководитель:
к.х.н. Логвина Н.А.

Москва 2012

Оглавление

Введение

На концах хромосом присутствуют специальные ДНК-белковые структуры – теломеры, защищающие концы хромосом от деградации и слияния. Так как аппарат репликации клетки не способен обеспечивать полную репликацию концевых участков хромосом, существует специальный фермент – теломераза, достраивающие теломерные повторы ДНК [1]. Тонко регулируется количество теломеразы в клетках различного типа [2, 3]. В связи с этим (в человеческих клетках), угнетение активности теломеразы, укорочение длины теломер и как следствие – сенессенс, ведут к ограничению потенциала деления клетки и предотвращению перерождения. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, как хорошо изученный и удобный для культивирования и генетических манипуляций эукариотический микроорганизм, являются хорошей модельной системой для изучения теломеразы.

Теломеразный комплекс дрожжей Saccharomyces cerevisiae состоит из трех белков Est, найденных при поиске генов, делеция которых приводила бы к сенессенс фенотипу с отсутствием теломеразной активности.

Не смотря на интенсивное изучение теломеразы, до сих пор не полностью ясна роль белка Est3 в работе комплекса. Существует предположение, что данный белок способен образовывать комплексы с G-квадруплексами, структурами, образующимися под действием белка Est1. В данной работе определяется константа связывания Est3 и квадруплексов, что поможет в более детальном понимании этапов работы теломеразы.

Список сокращений

Литературный обзор

Общий обзор

О механизме работы белка Est3 теломеразного комплекса дрожжей не найдено ни одного источника потому как такими исследованиями никто не занимался. Можно привести лишь некоторые вводные данные.

На концах линейных хромосом находятся специализированные структуры ДНК, называемые теломерами. Они представляют собой одноцепочечные последовательности ДНК. (ссылка)Эти последовательности стабилизируют концы хромосом, и, как предполагается, формируют структуры, называемые G-квадруплексами. (ссылка) Известно, что ДНК-полимераза не может реплицировать 3’ концы хромосом, это делает фермент теломераза. Предполагается, что один из белков теломеразы образует комплекс с G-квадруплеском, что скорее всего является подготовительной стадией для начала работы фермента по реплицированию 3’ конца хромосомы (ссылка).

Стоит отметить, что на концах хромосом могут образовываться и другие структуры. Одноцепочечная ДНК может располагаться в виде широкого кольца, стабилизированного теломерными белками. Данная структура называется Т-петлей. В конце Т-петли одноцепочечная теломерная ДНК может присоединяться к двуцепочечной, нарушая спривание цепочек в этой молекуле и образуя связи с одной из цепей. Это трехцепочечное образование называется Д-петля (ссылка).

Т еломерная ДНК дрожжей

Теломеры дрожжей Saccharomyces cerevisiae, характеризуются гетерогенными нерегулярными повторами, последовательность которых сокращенно можно записать как G_1-3T или G_2-3(TG)_1-6 [4, 5]. Это отличие обусловлено, по всей видимости, неточным копированием матричного участка дрожжевой теломеразной РНК (TLC1). Гетерогенные теломерные повторы являются особенностью не только теломер Saccharomyces cerevisiae, они свойственны также большинству других дрожжей рода Saccharomyces, а, корме того, многим систематически более отдаленным дрожжам, таким как Kluyveromyces lactis и Candida albicans. Необходимо также отметить, что теломерные повторы дрожжей порой могут состоять из большого числа нуклеотидов (до 26). Гетерогенность дрожжевых теломерных повторов оказалась свойством, которое удалось использовать экспериментально и с его помощью продемонстрировать, что концы дрожжевых хромосом имеют очень динамическую структуру. В процессе анализа нуклеотидных последовательностей дрожжевых теломер было обнаружено, что последние 40-100 нуклеотидов на самом конце хромосом характеризуются большой вариабельностью, проявляющейся по истечении одного или нескольких клеточных циклов. Тот факт, что эта вариабельность полностью исчезает при выключении в клетках Saccharomyces cerevisiae теломеразной активности, указывает на то, что синтез теломерных повторов идет лишь на самом крайнем участке хромосом. Причем, длинна этого участка намного больше, чем можно было бы ожидать, исходя из предположения, что теломераза компенсирует утраченные в процессе репликации нуклеотиды (3-5 за клеточный цикл). Оказалось, что теломераза действует крайне избирательно, удлиняя только самые короткие теломеры в пределах одной клетки. В заключение можно сказать, что баланс между укорочением теломеры и ее теломеразным удлинением есть процесс крайне сложный и тонкорегулируемый, все подробности которого до сих пор не ясны.

Субтеломерные области дрожжевых хромосом

При движении вглубь хромосом сразу после G-богатой области теломерных повторов следует так называемая субтеломерная область. Она также состоит из различных повторяющихся нуклеотиднных последовательностей, длина ее составляет в среднем около 2500 пар оснований. Исторически повторяющиеся нуклеотидные последовательности субтеломерных областей дрожжевых хромосом были разделены на две основные группы, которые получили название X и Y’ элементы [6, 7]. Однако, в процессе дальнейшего изучения дрожжевых хромосом, эта классификация приобрела более детальный характер. Было выяснено, например, что X элементы могут различаться между собой. В Saccharomyces cerevisiae на конце каждой хромосомы всегда обязательно присутствует так называемый коровый X элемент, рядом с которым могут располагаться протяженные последовательности небольших гетерогенных субтеломерных повторов, которые называются A, B, C, D элементы. Биологическая роль субтеломерных повторов пока не до конца выяснена. На сегодняшний день можно говорить о том, что субтеломерные области влияют на различные процессы, происходящие в клетках. Один из них - альтернативный теломеразному синтезу процесс поддержания длины теломер при помощи гомологической рекомбинации. Также, в суббтеломерных областях существуют так называемые CpG-островки (богатые C нуклеотидами), которые участвуют в первичном связывании теломерной РНК (TERRA) с теломерой.

Теломеразный комплекс дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Белковые субъединицы дрожжевого теломеразного комплекса были найдены при поиске генов, удаление которых приводило бы к фенотипу с отсутствием теломеразной активности. Этот фенотип еще называют Est (Ever Shorter Telomeres), и он характеризуется тем, что при каждом клеточном делении происходит укорочение длины теломер, что в итоге приводит к сенессенсу. В результате поиска мутантов с такими фенотипами были открыты компоненты теломеразного комплекса, белки Est1, Est2, Est3 (а также теломеразная РНК). Ген, кодирующий теломеразную РНК Saccharomyces cerevisiae назвали TLC1. Исследователей также волновал вопрос, обладают ли данные белки какими-либо другими функциями в клетке, кроме того, что они учатствуют в процессе удлинения теломер.

В составе теломеразы дрожжей Est2 является обратно-транскриптазной субъеденицей и вместе с теломеразной РНК образует так называемый коровый фермент, который достаточен для проявления теломеразной активности in vitro.

Теломеразные РНК различных организмов довольно сильно различаются друг от друга по размерам и вторичной структуре. В основном, длина теломеразной РНК возрастает от низших эукариот к высшим. Теломеразная РНК Saccharomyces cerevisiae имеет длину примерно 1300 нуклеотидных остатков. Как оказалось при дальнейших исследованиях, для функционирования теломеразы Saccharomyces cerevisiae важно меньше половины нуклеотидов (около 500). Появилась теория о том, что теломеразная РНК служит «гибкой платформой, основанием для связывания ключевых белков».

Белки Est1 и Est3 обладают регуляторными функциями и необходимы для работы теломеразы in vivo. Как оказалось, Est1 в Saccharomyces cerevisiae может защищать концы хромосом от деградации (возможно, что и Est2 также участвует в этом процессе). Также, недавние исследования показали, что белок Est1 способен формировать G-квадруплексы, возможно, необходимые для посадки теломеразы на теломеру. Первичной регуляторной ролью Est1 является доставка теломеразы к концевым участкам хромосом и продвижение белка Est2 (обратной транскриптазы) по теломере.

Белок Est3 взаимодействует с одноцепочечным теломерным олигонуклеотидом в последовательности G-богатой цепи теломерной ДНК в присутствии ATP и GTP (ADP и GDP снижали взаимодействие) []. С РНК олигонуклеотидами связывание в этом случае было сильнее. На этом основании можно утверждать, что Est3 сильнее взаимодействует с РНК. Стоит отметить, что РНК олигомер с последовательностью G-богатой цепи теломеразной РНК (TERRA) имеет несколько конформаций, детектируемых в полиакриамидном геле которые исчезали при добавлении избытка белка. Это может свидетельствовать о том, что белок Est3 специфично связывается только с определенной конформацией РНК.

Также имеются сведения о том, что Est3 способен специфично разворачивать ДНК/РНК гетеродуплексы в присутствии ATP и GTP (ADP и GDP снижали взаимодействие) [] . Опять же, с позиции недавних открытий, можно предположить, что Est3 участвует в работе TERRA.

G-квадруплексы

G-квадруплексы впервые были обнаружены в 1962 году и практически не изучались, пока в работе, посвященной теломеразе и выпущенной в 1990 году, не была показана важность G-квадруплексов в работе теломеразы. В связи с этим сегодня интерес к гуаниновым не уотсон-криковским структурам сильно возрос. Активно изучается роль G-квадруплексов в жизни клетки.

G-квадруплексы представляют собой стопку координированных G-квартетов. Каждый G-квартет состоит из четырех 5’-GMP (что обуславливает хиральность комплекса в целом), связанных между собой водородными связями. G-квадруплекс электростатически нестабилен, поэтому часто в промежутках между G-квартетами находятся положительно заряженные ионы щелочных металлов. Показано [ссылочка], что наибольшая стабильность достигается в случае иона K+ (для него даже приводятся термодинамические данные значений ΔH и ΔS).Одноцепочечная ДНК по-

Характеристики

Тип файла документ

Документы такого типа открываются такими программами, как Microsoft Office Word на компьютерах Windows, Apple Pages на компьютерах Mac, Open Office - бесплатная альтернатива на различных платформах, в том числе Linux. Наиболее простым и современным решением будут Google документы, так как открываются онлайн без скачивания прямо в браузере на любой платформе. Существуют российские качественные аналоги, например от Яндекса.

Будьте внимательны на мобильных устройствах, так как там используются упрощённый функционал даже в официальном приложении от Microsoft, поэтому для просмотра скачивайте PDF-версию. А если нужно редактировать файл, то используйте оригинальный файл.

Файлы такого типа обычно разбиты на страницы, а текст может быть форматированным (жирный, курсив, выбор шрифта, таблицы и т.п.), а также в него можно добавлять изображения. Формат идеально подходит для рефератов, докладов и РПЗ курсовых проектов, которые необходимо распечатать. Кстати перед печатью также сохраняйте файл в PDF, так как принтер может начудить со шрифтами.

Список файлов курсовой работы