С.В. Мугинова - Методические указания к курсу аналитической химии (1110118), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Интенсивность люминесценции и концентрациялюминофораЕсли интенсивность люминесценции характеризоватьчислом квантов, испускаемых люминофором в единице объемав единицу времени, то, в соответствии с основным закономсветопоглощенияиопределениемквантовоговыходалюминесценции, зависимость интенсивности люминесценцииот концентрации люминофора в растворе выражаетсяформулой:(4.10)I = ϕк Ф0 (1 − T) = ϕк Ф0 (1−10 −klc),– мощность возбуждающего излучения (числогде Ф0возбуждающих квантов, падающих на единицу объема растворалюминофора в единицу времени), Т – пропусканиелюминофора при длине волны возбуждающего излучения, k –коэффициент поглощения люминофора при длине волнывозбуждающегоизлучения.Еслидоляпоглощенного72люминофором возбуждающего излучения мала (klc < 0,05),уравнение (4.10) упрощается:(4.11)I = 2,303 ϕк Ф0 klc.Такимобразом,интенсивностьлюминесценциипропорциональнаквантовомувыходулюминесценции,интенсивности возбуждающего излучения, коэффициентупоглощения и концентрации люминофора.
Уравнение (4.11)являетсяматематическимоснованиемколичественноголюминесцентногоанализа.Зависимостьинтенсивностилюминесценции от концентрации люминофора часто сохраняетлинейный характер в пределах трех-четырех порядковвеличины концентрации. Отклонения от линейности вызванырядом причин: невыполнением соотношения klc<0,05; явлениемконцентрационноготушения,ограничивающимверхнийдиапазон линейности концентраций на уровне 10-4 М;эффектами внутреннего фильтра ⎯ экранирующим эффектом иэффектом реабсорбции.Эффект экранирования связан с поглощением частивозбуждающегоизлученияпостороннимивеществами,вследствиечегоуменьшаетсяколичествофотонов,поглощенных самим люминофором. Это вызывает снижениеинтенсивности люминесценции последнего.
С учетом эффектаэкранирования выражение для интенсивности люминесценциипри монохроматическом возбуждении имеет вид:(4.12)I = ϕк Ф0 (1 − T′ Т) А / (А′+А)где соответственно А, Т – оптическая плотность и пропусканиелюминофора; А′, Т′ – оптическая плотность и пропусканиепосторонних веществ. Отношение А/(А′+А) показывает долюизлучения, поглощенного люминофором.Под реабсорбцией понимают поглощение квантовлюминесценции в толще раствора.
Испускаемые люминофоромфотоны могут поглощаться как самим люминофором, так имолекулами других веществ, присутствующих в растворе.Реабсорбцияминимальнаприиспользованиислабопоглощающихрастворовипривозбуждениилюминесценции при длине волны, соответствующей максимумупоглощения люминофора.73Работа 1Проверка правила зеркальной симметрииспектров поглощения и флуоресценции рибофлавинаРибофлавин (витамин В2, С17Н20N4O6, М.м. 376,37 г/моль)является биологически активным веществом, играющимважную роль в поддержании здоровья человека. Витамин B2необходим для образования красных кровяных телец, антител,регуляции роста, нормального функционирования щитовиднойжелезы и репродуктивных органов.Биологическаярольрибофлавинаопределяетсявхождениемегопроизводных—коферментов—флавинмононуклеотида (ФМН), флавинадениндинуклеотида(ФАД) и флавинадениндииуоклеотида в состав большого числаважнейших окислительно-восстановительных ферментов.Рис.
4.1. Структурная формула рибофлавина.Препараты рибофлавина и ФМН применяют дляпрофилактики и лечения недостаточности витамина B2, прикожных заболеваниях, вяло заживающих ранах, заболеванияхглаз, нарушении функции желудочно-кишечного тракта,диабете, анемиях, циррозе печени.В данной работе для определения рибофлавинаиспользована его способность флуоресцировать при облученииего раствора электромагнитным излучением с длинами волн440 – 450 нм.Реагенты, аппаратураСтандартный раствор рибофлавина 4 мкг/мл (10 мкМ).Приготовление: точную навеску 0.0100 г стандартногообразца рибофлавина растворяют в 90-100 мл 1%-ного74раствора уксусной кислоты в мерной колбе ёмкостью250,0 мл при нагревании на водяной бане. Послеохлаждения доводят объем раствора до метки раствором1%-ной уксусной кислоты и перемешивают.
1 мл растворастандартного образца содержит 0,00004 г рибофлавина.Раствор устойчив в течение 1 месяца при хранении втемном месте. Раствор с концентрацией 4 мкг/мл готовятразбавлением исходного стандартного раствора водой.Спектрофлуориметр.Кварцевые кюветы, l = 1 см.Выполнение определения. Измеряют интенсивностьфлуоресценции стандартного раствора рибофлавина вдиапазоне длин волн 450 – 650 нм и определяют положениеλмакс флуоресценции.Используя результаты измерений, выполненных в п. 1.
иданные спектра поглощения рибофлавина, представленные втабл. 4.1, на одном графике строят нормализованные спектрыпоглощения (в координатах ε/ν ⎯ ν) и флуоресценции (вкоординатах I/ν4 ⎯ ν) рибофлавина.Таблица 4.1. Спектр поглощения рибофлавина (с = 12,5мкг/мл=33 мкМ, l = 1 см)λ, нм4004100,296 0,302А460λ, нм 4550,351 0,333А4200,3274650,3134300,3524700,2884350,3634800,2144400,3714900,1254450,3755000,0604500,3675100,031По точке пересечения обоих спектров определяютзначение ν0.Проверяют выполнение правила зеркальной симметрии,построив график зависимости Δν = νa - νf от νa. Если при этомполучится прямая с тангенсом угла наклона ∼ 2, то правилозеркальной симметрии соблюдается.75Pабота 2Флуориметрическое определение рибофлавинав инъекционных растворахЦель данной работы состоит в определении концентрациирибофлавина в его инъекционном растворе методомфлуориметрии.Для выполнения определения необходимовыбрать длины волн возбуждающего и регистрируемогоизлучений и соответствующие светофильтры, построитьградуировочный график и с его помощью определитьсодержание рибофлавина в анализируемом растворе.Реагенты, аппаратура, посудаСтандартный раствор рибофлавина 12,5 мкг/мл.Раствор рибофлавина мононуклеотида в инъекциях(ампулы).Анализатор жидкости «Флюорат-02-03М».Набор светофильтров.Кварцевые кюветы, l = 1 см.Мерные колбы ёмкостью 25,0 и 200,0 мл.Пипетки, 1,00; 2,00 и 5,00 мл.Выполнение определения.
1). Выбор светофильтров. Наосновании спектров поглощения (табл. 4.1) и флуоресценции(работа 1) выбирают оптимальные длины волн возбужденияфлуоресценции и регистрации флуоресценции. Используяданные табл. 4.2, выбирают оптимальные светофильтры дляканала возбуждения и регистрации флуоресценции иустанавливают их в анализатор.Таблица 4.2. Характеристики светофильтров для каналоввозбуждения и регистрации флуоресценцииМаркаМаксимумПолосасветофильтрапропускания, нмпропускания, нм1266240-2803316300-3407380360-390B2-1440380-500B2-2540500-620762) Построение градуировочного графика.
В пяти мерныхколбах ёмкостью 25,0 мл готовят серию раствороврибофлавина с содержанием (мкг/мл): 0,25; 0,50; 0,75, 1,0.Следует уделить особое внимание чистоте используемойпосуды и кювет. Мерные колбы тщательно промываютраствором соды, а кюветы ⎯ концентрированной солянойкислотой (под тягой), после чего многократно ополаскивают ихводопроводной и два раза дистиллированной водой.Измеряют интенсивность флуоресценции контрольногоопыта (дистиллированная вода) и растворов стандартной сериив порядке увеличения концентрации люминофора (длинаоптического пути – 1 см). По полученным данным строятградуировочныйграфиквкоординатахинтенсивностьфлуоресценции (I) ⎯ концентрация рибофлавина, мкг/мл.3) Определение содержания рибофлавина в инъекции.Ампулу с инъекцией рибофлавина аккуратно вскрывают исодержащийся в ней раствор количественно (смывая растворсо стенок ампулы не менее 7 раз дистиллированной водой)переносят в колбу ёмкостью 200,0 мл, разбавляют до метки иперемешивают.
Далее 0,50 мл полученного раствора переносятв колбу ёмкостью 25,0 мл, разбавляют до метки иперемешивают.Содержание рибофлавина в анализируемом растворенаходят по градуировочному графику, измерив интенсивностьего флуоресценции. Рассчитывают общее содержаниерибофлавина в инъекции и сравнивают его с паспортнымиданными.4) Оценка предела обнаружения рибофлавина. Проводят10 измерений флуоресценции раствора контрольного опыта.Предел обнаружения (сmin) методики определения рибофлавинарассчитывают по 3S-критерию: cmin =3s0, где s0 — стандартноеSотклонение для контрольного опыта (n=10), S – среднеезначение крутизны градуировочного графика.
Величинупредела обнаружения выражают в мкг/мл и моль/л.Работа на анализаторе «Флюорат-02-3М»1. Включите анализатор тумблером «Сеть». На дисплеепоявляется заставка.77Люмэкс 05.12Флюорат – 02Санкт-Петербург2. Сбросьте ее нажатием любой клавиши. Анализаторперейдет в «Основное меню» для того вещества, котороеопределяли последним перед выключением прибора.Рибф05.12ФамилияГруппаИзмерениеархив3. Установите светофильтры в каналы возбуждения ирегистрации согласно методике выполнения измерений.4. Для вхождения в список определяемых веществпереведите курсор на левую верхнюю позицию «Основногоменю» и, нажав клавишу «Еnt», войдите в меню «Списоквеществ».
Установите на свободную позицию и наберитенужноеназваниевещества(рибф).Еслиназваниеопределяемого вещества уже внесено в меню, этот пунктпропустите.РибфАПАВПоверМедьФенолХромНП5. Перейдите в меню «Выбор метода». Для этогоустановите курсор на названии вещества и нажмите клавишу«Еnt». Далее перейдите в меню «Методы измерения»нажатием клавиши «Еnt». Выберите метод «Люминесценция».После выбора метода нажатием клавиши «Еsc» вернитесь вменю «Выбор метода».78Рибфвозб. рег.ЛюминесценцияГрадуировка⇒EntЛюминесценцияФосфоресценцияХемилюминесценцияФотометрия6.Дляосуществленияпереходавменю«Градуировочная таблица» установите курсор на пункт«градуировка» и нажмите клавишу «Еnt». Выйти из меню можнонажатием клавиш «Еsc».Рибфвозб.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
