Структурные изменения хрящевой ткани при неразрушающем лазерном воздействии с длиной волны 1,56 мкм (1105752), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Длина световой волны флюоресценции всегда больше длиныволны возбуждающего излучения [7,42]. Собственной флюоресценцией обладает любаяклетка живого организма, но интенсивность ее, как правило, оказывается слабой.Собственной флюоресценцией обладают также серотонин и катехоламины (адреналин,норадреналин) [7].
Для усиления флюоресценции применяют обработку тканифлюорохромными красителями. Анализ жизнеспособности клеток удобно проводитьпри использовании флюорохрома акридинового оранжевого, при взаимодействии скоторым ДНК клеток излучает зеленое свечение, а РНК – красное. Еще одним способомусиления контраста изображения в световой микроскопии является метод фазовогоконтраста [42], в котором за счет особенностей устройства оптики создаетсявозможность преобразовывать невоспринимаемые глазом фазовые изменения света,прошедшего через препарат, в изменения его амплитуды.
Такое устройство объективапозволяет различать структуры по показателю их преломления.Рельеф поверхности клеток и биомакромолекул, а также количественныехарактеристики ткани, такие как масса отдельных элементов, можно исследоватьметодом интерференционной или дифференциальной интерференционной микроскопии[7]. В данных методах свет, посылаемый на образец, разделяется на два потока: одинпроходит через образец и меняет фазу колебания, а другой минует образец, непретерпеваяизменений.Вобъективедвасветовыхпотокасоединяютсяиинтерферируют. Благодаря такому устройству, участки образца различной толщины иплотности обладают различной степенью контрастности.Использованиеконфокальногомикроскопатакжепозволяетсущественноповысить контраст изображения за счет отрезания апертурой фонового света,рассеянного из глубины образца [42].
Такое устройство обеспечивает возможностьнаблюдения с большой четкостью биообъектов, показатель преломления которыхблизок к показателю преломления воздуха.1.3.1.2. Электронная микроскопияМетоды сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии позволяютизучать объекты в широком диапазоне увеличений от макроуровня организации31матрикса до самых тонких клеточных мембран и ДНК структуры клеточных ядер. ПЭМпозволяет с большой прецезионностью исследовать клеточные органеллы и молекулыматрикса, а СЭМ - получать объемные изображения поверхности [7,64].
В данномметодебольшуюсложностьпредставляетпробоподготовка,таккакобразцыбиологических тканей, как правило, очень слабо взаимодействуют с электронами.Используют ультратонкие срезы (до 50 нм), которые получают после многостадийнойпроцедуры фиксации, высушивания тканей и заливки в твердые среды (смолы). Дляповышения контраста изображения применяют различные типы окрашивания на основетяжелых металлов. Наиболее распространенными контрастными агентами являютсяуранилацетат и цитрат свинца [64]. Криотомирование позволяет получать тонкие сколыткани в тех случаях, когда химическая обработка и помещение в смолу не могут бытьприменены [65].
Тогда ткани быстро охлаждают до -196⁰С в жидком азоте. Этозамедляет процессы клеточного метаболизма и перехода воды из жидкого в твердоесостояние и позволяет изучать, например, активность ферментов и иммунохимическиереакции [7]. Сверхвысоковольтная электронная микроскопия использует напряжения до3 000 000 В для проведения трехмерной визуализации толстых объектов с высокимразрешением до 0,5 нм [7]. Тем не менее, методы электронной микроскопиималопригодныдляисследованияпространственныхконформацийбиомолекулвследствие сильного разрушающего воздействия на стадиях пробоподготовки иоблучения электронным пучком большого напряжения.1.3.1.3.
Атомно-силовая микроскопияВ данном методе осуществляется микрозондирование поверхности образца.Между зондом, толщина сканирующей головки которого составляет всего несколькоатомарных слоев, и поверхностью образца устанавливается баланс взаимодействияопределенной природы, куда могут входить электростатические, магнитные, Ван дерВаальсовые, дисперсионные и другие взаимодействия [66].
Принципиальная схемаустройства атомно-силового микроскопа приведена на Рис.8. Система обратной связиподдерживает на постоянном уровне сигнал, соответствующий силе рабочеговзаимодействия, изменяя Z-координату зонда. Поскольку в процессе сканирования силавзаимодействия изменяется в зависимости от структуры поверхности, усилия системыобратной связи на поддержание ее постоянства коррелируют со свойствами изучаемойповерхности. Различают три режима получения изображения: (1) контактный, когда32зонд касается поверхности образца; (2) полуконтактный, когда зонд совершает надобразцом осциллирующие колебания, касаясь поверхности в нижней части своейтраектории; (3) бесконтактный, когда зонд осциллирует над образцом без касанияповерхности.
В режиме (3) анализируется вариация Z, необходимая для поддержанияпостоянной амплитуды колебания зонда. Позиционирование образца относительнозондаосуществляетсяспомощьюпьезоманипулятора.Зондированиеобразцаосуществляется с помощью специальной упругой консоли – левера (кантилевера) сострым зондом на конце. Такие консоли изготавливаются фотолитографией итравлением из кремния. Чаще всего используют консоли из кремния, оксида илинитрида кремния [67].Рисунок 8. Принципиальная схема устройства экспериментальной ячейки АСМ [68].АСМ представляет собой удобный метод анализа биообъектов, так как она нетребует разрушающей пробоподготовки, как в случае с электронной микроскопией.
Ктомужеанализтопографииповерхностипозволяетпроводитьизмеренияшероховатости, зернистости, впадин и наклона, строить 3D модели поверхности [67]. Впоследнее время развиваются методики АСМ анализа упругих свойств различныхбиосистем, в том числе компонентов хрящевой ткани [69]. Визуализация коллагеновогокаркаса хрящевой ткани методом АСМ может быть осуществлена без дополнительнойобработки [70], в то время как для получения изображений протеогликановых агрегатовнеобходимо проводить их ферментативное выделение [71]. В работе [24] былопредложено проводить комплексный анализ АСМ для детектирования ранних стадийдеградации хрящевой ткани.
На основе измерений толщины и упругости коллагеновых33фибрилл в суставном хряще мышей была выявлена четкая зависимость междуколичеством деградирующих фибрилл и возрастом животного. Было установлено, чторанние изменения начинаются с деградации отдельных коллагеновых фибрилл иснижения содержания гликозаминогликанов. В более ранних работах, посвященныханализу протеогликановой подсистемы, было установлено, что такие заболевания какостеоартрит,ревматоидныйгликозаминогликановымиартритмолекуламиидр.могутспособностибытьквызваныобразованиюутрачиваниюустойчивыхагрегатов [72,73]. Нарушение свойств протеогликанов приводит к большей уязвимостиколлагеновой сети для механического поражения и ее деградации.АСМ изображения хряща носовой перегородки, облученного CO2-лазером врежиме изменения формы, позволили установить наличие субмикропор и каналовразмером 100 – 400 нм, отличающихся от пор интактного хряща, размер которыхварьировался в пределах 20 – 30 нм.
[1] (Рис.9).Рисунок 9. АСМ изображение пор в хряще носовой перегородки [1].1.3.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия.Физико-химические изменения в хрящевой ткани после лазерного воздействия, вчастности, степень денатурации коллагена, могут быть исследованы методом ДСК.Устройство ячейки ДСК позволяет определять тепловой поток, который вычисляется поразности температур в исследуемом образце и образце сравнения в один и тот жемомент времени. На Рис.10 приведена принципиальная схема прибора ДСК [74].
Вприборе с помощью термопар измеряется температура симметрично установленныхтиглей с исследуемым образцом и образцом сравнения.34Рисунок 10. Принципиальная схема устройства дифференциального сканирующегокалориметра. F (furnace) – нагреватель; TF – температура нагревателя; ∆l – расстояние междунагревателем и тиглем; S (sample) – исследуемый образец; R (reference) – образец сравнения;ФFS и ФFR – тепловые потоки от нагревателя к образцам; TmS и TmR – измеренные температурыобразцов [74].В теории ДСК существует несколько приближений.
Нулевое приближениеподразумевает отсутствие химических или фазовых превращений в исследуемомобразце. Принимаются следующие утверждения:1. Состояние системы является стационарным, т. е. тепловой поток не зависитот времени.2. Теплообмен между ячейкой с образцом и ячейкой сравнения отсутствует.3. Наличием нескольких границ раздела фаз (образец/тигель, тигель/сенсор,сенсор/теплопроводящая колонка) можно пренебречь.4. Учитывается только теплоемкость образца и эталона.5. Измеряемые температуры приписываются непосредственно образцу иэталону.При этом считается, что все тепло передается от теплопроводящей колонки кобразцу путем теплопроводности, исключая конвекцию и тепловое излучение.
В рамкахданного приближения справедлива следующая зависимость:DSC ~ ∆TSR = − rβ ∆C p , SR ,где DSC − аналитический сигнал прибора; ∆TSR − разность температур исследуемогообразца и образца сравнения; r − тепловое сопротивление проводника; r =∆x, ∆x −Sλ35длина теплопроводящего участка; β − скорость изменения температуры нагревателя;C p ,SR − разность изобарных теплоемкостей исследуемого образца и образца сравнения.При переходе к системам с химическими реакциями или фазовыми переходамитеоретическая модель изменяется.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
