Структурные изменения хрящевой ткани при неразрушающем лазерном воздействии с длиной волны 1,56 мкм (1105752), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Признаки регенерации фиксировались через месяц послеоперации. Было установлено, что клетки восстановленной ткани соответствуютхондроцитам гиалинового хряща, в то время как матрикс представляет собойсмешанный гиалиново-фиброзный тип. В дальнейшем данная процедура была успешноприменена в клинических испытаниях на человеческом межпозвонковом диске прииспользовании лечебной установки на основе эрбиевого волоконного лазера с длинойволны 1,56 мкм [55]. Проведенные исследования показали, что возможный механизмлазерно-индуцированной регенерации хрящевой ткани включает следующие аспекты:(1)термо-механическиенеравномерныйосцилляциилазерныйнагревактивируютспособствуетклеточныйметаболизм;расширению(2)субмикропор,обеспечивающих доставку питательных веществ; (3) повышение концентрации ионовCa2+ в областях механического сжатия.
Лазерная регенерация суставов была успешнопродемонстрирована для суставов кроликов и минисвиней [10,53]. Воздействиюподвергались дефекты глубиной 0,5 – 0,7 мм и размером 3 – 15 мм. Было показано, чточерез 6 недель после воздействия облученные дефекты полностью восстанавливаются изаполняются хрящевой тканью гиалинового и гиалиново-фиброзного типа.261.2.4.
Проблемы ранней диагностики деградации хряща и локализациилазерного воздействия.Актуальнымипроблемамивосстановительноймедициныхрящаявляютсявозможность ранней диагностики деградации хряща, а также локализация лечебноговоздействия в областях, содержащих дефекты, для снижения возможных негативныхпоследствий воздействия на соседние здоровые области ткани. В настоящее времянеинвазивная клиническая диагностика состояния суставов и спины проводитсяметодами оптической когерентной и магнитно-резонансной томографии (ОКТ, МРТ).Предельное разрешение данных методов составляет сотни микрометров [56,57]. Какправило, диагностика позволяет обнаружить дефекты порядка нескольких миллиметров,свидетельствующих уже о серьезной стадии развития заболевания. Однако былопоказано, что развитие деградации хрящевой ткани начинается локально намолекулярном уровне с образования нано- и микродефектов, которым предшествуетнарушение структуры протеогликанов и дефибриллизация коллагена хряща [24].Развитие методов повышения чувствительности диагностики поможет обнаружитьдефекты на ранней стадии их появления.
Одним из возможных решений даннойпроблемы является введение добавок, поглощающих лазерное излучение (для ОКТ) илиповышающих сигнал МРТ. Таковыми могут являться магнитные наночастицы приусловии их селективного введения в дефекты хрящевой структуры, а такжебезопасности их использования для компонентов ткани и организма в целом. Впоследнеевремяприменениенаночастицоткрываетновыевозможностидлямедицинской диагностики и терапии там, где невозможно улучшение другимиметодами.
Например, в ОКТ наночастицы с сильной люминесценцией и стабильностьюк выгоранию могут заменить органические красители, используемые на практике [58].МРТ позволяет проводить послойную диагностику большинства внутренних органов,включая мозг и опорно-двигательный аппарат. Поэтому повышение чувствительностиданного метода представляет собой насущную задачу. Принцип действия получениясигнала МРТ основан на разнице двух характеристических времен Т1 и Т2, которыесоответствуют времени спин-решеточной релаксации - возвращению ядерных спиновпротонов к равновесному состоянию (магнитные моменты ядер выстраиваются вдольнаправления внешнего постоянного магнитного поля) после возбуждения их импульсом27переменного магнитного поля и времени спин-спиновой релаксации протонов.
Данныевремена релаксации зависят от окружения протонов и от состояния тканей. Основнойтрудностью диагностики МРТ, существенно снижающей возможности ее применения,является малая разница времен релаксации для большинства случаев развитиязаболеваний на ранней стадии. Таким образом, введение контрастных агентовприобретает актуальность. Было продемонстрировано, что во многих случаяхиспользование магнитных наночастиц более эффективно, чем стандартного магнитноговещества на основе гадолиния [59,60]. Наночастицы на основе железа обладаютбольшим магнитным моментом в присутствии внешнего магнитного поля иобеспечивают снижение времени релаксации Т2.
В зависимости от состава и размерарассматриваются различные медицинские применения магнитных наночастц, такие какдиагностикаметастазпечениилимфатическойсистемы,воспалительныхидегенеративных заболеваний внутренних органов [60].Попытки диагностики состояния хрящевой ткани с помощью введения магнитныхнаночастиц предпринимались в ряде исследований [61,62].
В настоящей работерассматриваются аспекты селективного введения (импрегнации) магнитных наночастицв дефекты хрящевой структуры на ранних стадиях их развития. Моделирование раннихстадий хрящевой деградации планируется проводить посредством лазерного облученияхряща в неразрушающем режиме. Поскольку лазерное воздействие приводит кобразованию субмикропор размером 100 – 300 нм [37], что соответствует размерудефектов на ранней стадии [24], оно может быть использовано для создания моделейхряща,соответствующихраннейстадиидеградации.Локальностьлазерноговоздействия позволит отследить селективность импрегнации наночастиц в областяхткани, содержащих дефекты.1.3.
Методы исследования структуры хрящаВ настоящей работе будут рассматриваться структурные изменения в хрящевойткани при лазерном воздействии и импрегнации магнитных наночастиц. Данный разделпосвящен методам анализа, позволяющим исследовать структуру компонентов хряща:коллагена, протеогликанов и хондроцитов на различных уровнях их организации, атакже имеющиеся к настоящему моменту литературным данным о структуре хрящапосле неразрушающего лазерного воздействия.281.3.1. Микроскопия1.3.1.1. Световая микроскопияОсновными методами изучения биологических микрообъектов являются световаяи электронная микроскопия.
Минимальный размер структуры, различимой в световой иэлектронныйd0 =λ2n sin αмикроскопопределяетсянаименьшимразрешаемымрасстоянием, где λ – длина волны света, n – показатель преломления среды междуобразцом и объективом, α – «апертурный угол» (половина угла, который захватываетобъектив). У хороших микроскопов α близок к 90⁰, следовательно, предельноеразрешение близко к дифракционному пределу λ/2n. Минимальная длина волнывидимой части спектра составляет около 400 нм, а предельный различимый размер приn=1, соответственно, 200 нм. Это позволяет исследовать в световой микроскоп клетки,чьи размеры изменяются в широких пределах от 4 до 150 мкм, и более мелкиеклеточныеорганеллысдостаточнохорошимразрешением.Использованиеультрафиолетовой микроскопии с минимальной длиной волны 200 нм позволяетразличать объекты размером до 100 нм [7].
В световой микроскопии, как правило, дляанализа используют гистологические препараты в виде срезов ткани, но в ряде случаеванализируют их отпечаток или пленку. Подготовка препарата включает следующиестадии: (1) забор и фиксация материала, (2) обезвоживание и уплотнение, (3)изготовление срезов, (4) окрашивание или контрастирование [2].
В качестве фиксаторамогут выступать спирт, формалин, раствор солей тяжелых металлов, глютаровыйальдегид и т.д. Фиксация делает невозможным процессы разложения ткани и сохраняетее структуры в неизменном состоянии за счет протекания ряда физико-химическихпроцессов:высушивания,уплотнения,свертыванияферментов.Высушиваниепроводится посредством выдерживания материала в растворах спиртов возрастающейконцентрации.Уплотнениематериалапроизводитсяпутемпропитыванияегопарафином или органическими смолами. Далее производится микротомирование срезови их окрашивание. Различают обычные срезы толщиной около 5 мкм и полутонкиесрезы толщиной 1 мкм.
Анализ полутонких срезов дает больше информации осостояниицитоплазмыиклеточныхорганелл.Дляисследованияотдельныхкомпонентов биологических тканей применяют различные типы окрашивания срезов:используют кислые, основные и нейтральные гистологические красители [63].29Красительможетизбирательновзаимодействоватьсотдельнымитканевымикомпонентами, либо с целым рядом компонент. Так, эозин представляет собой кислыйкраситель, окрашивающий цитоплазму клеток в розово-оранжевый цвет за счетвзаимодействия с эозинофильными внутри- и внеклеточными белками. Его используютв комбинации с гематоксилином, окрашивающим в ярко-синий цвет компоненты,содержащие нуклеиновые кислоты: клеточное ядро, рибосомы и РНК-богатые участкицитоплазмы. Окраска гематоксилином и эозином является наиболее распространеннымметодом гистологического анализа состояния клеток и матрикса тканей.
Срезы,окрашенныегематоксилиномиэозином,анализируютнаналичиепикноза(сморщивание ядра, вызванное конденсацией хроматина), рексиса (распад клеточногоядра на части) и лизиса (растворение частиц распавшегося ядра в цитоплазме клетки)клеточных ядер, а по гомогенности окрашивания матрикса судят о его повреждениях[7].Краситель толуидиновый синий обладает метахроматическими свойствами. Этоозначает, что некоторые компоненты ткани при взаимодействии с ним могутокрашиваться в цвета, отличные от цветового тона самого красителя. При окраскетолуидиновым синим наблюдается метахромазия от красно-фиолетового до красного.Метахроматически могут окрашиваться вещества с большой молекулярной массой исодержащие свободные отрицательно заряженные группы.
В частности, толуидиновыйсиний является индикатором на кислые гликозаминогликаны, окрашивая их винтенсивный фиолетовый цвет. В таком случае, говоря об интенсивности метахромазии,подразумевают интенсивность фиолетового окрашивания. Толуидиновый синий такжевзаимодействует с РНК клеточных ядер, окрашивая их в синий цвет [63]. Поинтенсивности метахромазии можно судить о содержании в хрящевом препаратекислых гликозаминогликанов. При исследовании соединительных тканей такжераспространенным методом является окрашивание по Ван Гизону.
Окрашиваниепроизводится смесью кислого фуксина и пикриновой кислоты. Фуксин окрашиваетколлагеновые волокна в яркий розовато-красный цвет. Структуры ткани, не содержащиеколлагена, приобретают желтую окраску. Сравнительный анализ интенсивности игомогенности окрашивания дает информацию о содержании коллагена и возможныхповреждениях его структуры.30Разновидностью световой является флюоресцентная микроскопия. Данный методоснован на способности отдельных компонентов ткани излучать в видимом диапазонеспектра при возбуждении их короткими волнами ближнефиолетовой или синефиолетовой области.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
