Разработка методов иммуноанализа с использованием магнитных наномаркеров (1104599)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

На правах рукописиОрлов Алексей ВладимировичРАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ИММУНОАНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕММАГНИТНЫХ НАНОМАРКЕРОВСпециальность 03.01.02 – «Биофизика», 03.01.08 – «Биоинженерия»АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМосква 2014РаботавыполненавЛабораторииБиофотоникиФедеральногогосударственного бюджетного учреждения науки Института общей физики им.А.М. Прохорова Российской академии наук (ИОФ РАН).Научныйруководитель:Никитин Петр Иванович, к.ф.-м.н., заведующийлабораториейБиофотоникиФедеральногогосударственногобюджетногоучреждениянаукиИнститута общей физики им. А.М. Прохорова Российскойакадемии наукОфициальныеоппоненты:ПантелеевМихаилАлександрович,д.

ф.-м. н.,заведующий лабораторией Молекулярных механизмовгемостаза, Федеральное государственное бюджетноеучреждение науки Центр теоретических проблем физикохимической фармакологии Российской академии наукЕремин Сергей Александрович, д. х. н., руководительгруппы иммунохимических методов анализа, химическийфакультет Федерального государственного бюджетногообразовательногоучреждениявысшегопрофессиональногообразованияМосковскийгосударственный университет имени М.В.

ЛомоносоваВедущаяорганизация:Федеральное государственное бюджетное учреждениенауки Институт биоорганической химии им. академиковМ.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российскойакадемии наукЗащита диссертации состоится 10 апреля 2014 г. в __ часов на заседаниидиссертационного совета Д501.002.11 в Федеральном государственномбюджетном образовательном учреждении высшего профессиональногообразованияМосковскомгосударственномуниверситетеимениМ.В. Ломоносова, физический факультет.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московскогогосударственного университета имени М.В. Ломоносова.Автореферат разослан «__» _________ 2014 г.Ученый секретарьдиссертационного совета,кандидат технических наукСидороваА.Э.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемыВ последние годы значительное внимание исследователей во всем мире уделяетсяразработке биофизических методов для высокочувствительной количественной регистрациибиомолекул и их взаимодействий между собой.

В частности, высокая востребованность состороны таких отраслей, как фармацевтическая промышленность, медицинская диагностика,экологический мониторинг и др., диктует необходимость разработки точных и скоростныхметодов обнаружения белковых молекул в биологических образцах сложного состава (кровь,сыворотка, слюна, молоко и т.д.). Исследования в данном направлении требуютмеждисциплинарного подхода и чрезвычайно важны, поскольку их результаты могутиспользоваться для решения широкого круга научных и прикладных задач.Однимиммуноанализ.изнаиболееТрадиционныепопулярныхметодовколичественныедетекцииметодыбиомолекулиммуноанализа,являетсятакиекакиммуноферментный анализ, характеризуются длительным временем получения результата(не менее 2 ч). Относительно быстрые методы, позволяющие получить результат в течение10 мин, например иммунохроматографический анализ, как правило, дают толькокачественную оценку в терминах "да/нет".Перспективным подходом для увеличения чувствительности и сокращения временииммуноанализаявляетсяиспользованиемагнитныхнаночастиц(МЧ)вкачестведетектируемых меток.

Одним из преимуществ таких меток является возможность ихиспользования в непрозрачных или сильно рассеивающих средах, например, в сочетании стрехмернымитвердымифазами,гдеприменениетрадиционныхокрашенных,флуоресцентных и ферментных маркеров сильно ограничено.Выбор метода детекции применяемых меток – один из факторов, оказывающихсущественное влияние на эффективность иммуноанализа. Методы регистрации МЧ наоснове гигантского магнитного сопротивления (ГМС), как правило, характеризуютсяневысоким соотношением сигнал/шум, требуют съемных электрических контактов сосчитывающим устройством и весьма затратны для однократных применений.

Кроме того,ГМС-детекторы преимущественно используются в сочетании с магнитными кластерами,соизмеримыми по размеру с чувствительным элементом сенсора, что приводит к слабойзависимости сигналов от концентрации аналита и высокому неспецифическому связыванию.Одна из наиболее чувствительных методик регистрации МЧ, основанная на использованиикриогенных сверхпроводящих квантовых интерференционных магнетометров, являетсядостаточно дорогостоящей и труднодоступной для рутинного использования в медицинскойдиагностике и экологическом мониторинге.

Таким образом, разработка методов анализа,3использующих магнитные частицы в качестве меток в сочетании с методами регистрациитаких меток, обеспечивающими высокую чувствительность, доступность и высокоеотношение сигнал/шум, является перспективным направлением в разработке новыхподходов в биосенсорике и иммуноанализе.Одним из этапов разработки иммуноанализа является оптимизация его условий:выбор антител, способа их иммобилизации, времени инкубации и концентрациииммунореагентов, а также состава буферных и стабилизирующих растворов. Влияниекаждого из этих параметров можно оценить с помощью методов, использующих различныеметки, лишь на завершающей стадии иммуноанализа.

Безметочные оптические методы могутзначительно повысить эффективность разработки протокола иммуноанализа за счетколичественного мониторинга в режиме реального времени взаимодействий междубиомолекулами на каждой стадии анализа, а также сокращения времени и числа операций.Таким образом, развитие безметочных методик для изучения в реальном временимежмолекулярных взаимодействий также является актуальной задачей.Цели и задачи работыЦель работы состояла в разработке биофизических методов, основанных наиспользованиимагнитныхнаночастицвкачестведетектируемыхметок,длявысокочувствительной количественной регистрации биомолекул и их взаимодействий междусобой.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи: Разработка и верификация методики количественной оценки взаимодействия биомолекулмежду собой и с магнитными наночастицами путем мониторинга в режиме реальноговременикаждогоэтапаиммуноанализаспомощьюспектрально-корреляционнойинтерферометрии. Изучениеспомощьюметодаспектрально-корреляционнойинтерферометрииконформационных изменений при смене состава водного окружения слоя сополимеров N,Nдиметилакриламида и N-акрилоил-m-аминофенилборной кислоты, иммобилизованных настеклянной поверхности. Изучение влияния магнитных наночастиц на предел детекции метода спектральнокорреляционой интерферометрии при их использовании для амплификации сигнала посравнению с безметочной регистрацией. Разработка метода детекции биомолекул, основанного на использовании объемныхволоконных фильтров в качестве твердой фазы иммуноанализа и магнитных наномаркеров. Разработкаметодадетекциибиомолекул,основанногонапринципеиммунохроматографии с использованием МЧ в качестве меток в сочетании с методомрегистрации нелинейных магнитных материалов на комбинаторных частотах.4Научная новизна и практическая значимостьРазработан метод регистрации биомолекул, обладающий оригинальным сочетаниеманалитических характеристик: а) широким линейным диапазоном, составляющим более 3порядков концентрации аналита; б) малой продолжительностью анализа; в) возможностьюанализировать образцы практически любого объема, причем чувствительность метода растетпри увеличении объема образца; г) отсутствием пробоподготовки для биологическихобразцов сложного состава, например, цельного молока.

Данные свойства методапродемонстрированынапримередетекциитоксинов,продуцируемыхбактериямиЗолотистого стафилококка. Новизна метода заключается в применении объемныхволоконных фильтров в качестве твердой фазы анализа в сочетании с использованиеммагнитных наномаркеров, регистрируемых со всего объема фильтров методом детекциинелинейных магнетиков на комбинаторных частотах.

Применение фильтров обеспечиваетбольшую реакционную поверхность твердой фазы – 20 см2 в объеме около 35 мкл, а такжеэффективное взаимодействие и быстрое концентрирование антигена на твердой фазе симмобилизованными антителами непосредственно в ходе анализа. Применяемый подход длярегистрации МЧ характеризуется высоким отношением сигнал/шум, поскольку окружающиедиа- и парамагнитные материалы, такие как компоненты крови, стекло, вода, пластик и т.д.,не вносят вклад в детектируемый сигнал.Разработанколичественныйметодиммунохроматографическогоанализасиспользованием магнитных наномаркеров для регистрации в сыворотке крови человекаонкомаркера – простатического специфического антигена (ПСА). Данный метод совмещаетпреимущества лабораторных методов и экспресс-тестов на основе сухой химии: он обладаетвысокой чувствительностью и позволяет получать количественные результаты при простотеиспользования и коротком времени получения результата.Оба разработанных метода иммуноанализа могут найти практическое применение вобласти диагностики заболеваний и биобезопасности как в лабораторных, так и домашнихусловиях, а также для контроля пищевой продукции, экологическом мониторинге, вветеринарии и т.д.Разработана методика для количественного изучения взаимодействия биомолекул сцелью мониторинга каждой стадии иммуноанализа.

Методика основана на принципеспектрально-корреляционной интерферометрии с использованием в качестве сенсорныхчипов стандартных микроскопных покровных стекол. Методика успешно испытана напримереизучениявлиянияпептидногофрагмента(65–76)C-концевогодоменамоноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1) на взаимодействие MCP-1 с гепарином, атакже для изучения обратимых конформационных изменений полимерных структур на5поверхности стекла. Полученные результаты подтверждены независимыми методами:вискозиметрией,эллипсометрией,иммуноферментныманализом.сканирующейПродемонстрированаэлектронноймикроскопией,возможностьколичественногомониторинга каждого этапа иммуноанализа с использованием магнитных наночастиц вкачестве меток.

Оригинальность разработанного подхода заключается в возможностирегистрации в реальном времени взаимодействия между биомолекулами непосредственно настеклянной поверхности без нанесения дополнительных проводящих или диэлектрическихпленок. Разработанная методика может найти применение как для развития новых методовиммуноанализа, так и для широкого круга приложений, требующих количественной оценкидинамики межмолекулярных взаимодействий.На примере детекции кардиомаркера сердечного тропонина I (сТнI) показано, чтоприменение магнитных наночастиц в качестве меток приводит к усилению сигналаспектрально-корреляционнойинтерферометрии,причемиспользованиемагнитныхнаномаркеров приводит к увеличению чувствительности по сравнению с безметочнойрегистрацией примерно в 100 раз.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации