Разработка методов иммуноанализа с использованием магнитных наномаркеров (1104599), страница 3
Текст из файла (страница 3)
В экспериментах обнаружено, что по мереувеличения концентрации МСР-1 наблюдается возрастание толщины молекулярного слояпри связывании белка с гепарином, а также при связывании этого комплекса смоноклональными антителами мыши к МСР-1 человека (рис. 3, кривая 3). Кинетическаяконстанта ассоциации 576 нМ МСР-1 с гепарином, рассчитанная с использованием величинначальных скоростей равна 0,18 · 105 с–1 · М–1.
Константа диссоциации связывания МСР-1 сгепарином составила 0,44 мкМ, что согласуется с данными по низкоаффинному связываниюряда хемокинов с гликозаминогликанами. При добавлении пептида зарегистрированы оченьнизкие ответы на посадку МСР-1 практически при всех концентрациях и близкие по10значениям небольшие ответы (около 0,15 нм) на нанесение антител (рис. 3, кривая 4). Такимобразом, пептид препятствовал связыванию МСР-1 с гепарином.Рисунок 3. Ингибирующее влияние пептидного фрагмента МСР-1 на взаимодействие MCP-1 сгепарином: А) данные ИФА – зависимость оптической плотности субстрата от концентрации МСР-1без пептида (1) и при добавлении пептида в концентрации 100 мкМ (2); Б) данные СКИ – изменениятолщины Δd на этапе пропускания проявляющих антител в зависимости от концентрации МСР-1 безпептида (3) и при его концентрации 100 мкМ (4); В) – микрофотографии поверхностей стекла,демонстрирующие связывание МСР-1 с гепарином в отсутствие (сверху) и в присутствии (снизу)пептида, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопаТретьяглавапосвященаколичественномумониторингукаждойстадиииммуноанализа с помощью метода СКИ и амплификации СКИ-сигнала за счетиспользования магнитных наночастиц.Получены сенсограммы, которые демонстрируют все этапы магнитного сэндвичиммуноанализа при детекции 300 нг/мл раствора сТнI насенсорныхчипах сэпоксилированной и биотинилированной поверхностями (рис.
4). Для анализа на чипе сэпоксилированной поверхностью использовались ковалентно иммобилизованные нативныеантитела AT1, биотинилированные детектирующие антитела AТ2 и МЧ, покрытыестрептавидином.непосредственногоВоизбежаниесвязыванияпоявлениячастицсонеспецифическихсвободнымисигналовмолекуламибиотина,из-занабиотинилированной поверхности иммобилизовывались антитела AT1 изотипа IgG2b, вкачестве детектирующих применялись антитела AT2 изотипа IgG1, а также использовалисьмагнитные частицы, на поверхности которых были иммобилизованы антитела, специфичнораспознающие изотип антител AT2 (рис. 4). Установлено, что в сенсограммах, полученныхна разных поверхностях при одинаковой концентрации антигена, отличия, проявляющиесяна этапах АГ и АТ2, становятся еще более существенными на этапе МЧ.
Так, из рис. 4следует, что скорость связывания МЧ, конъюгированных со стрептавидином, выше скоростисвязывания МЧ, на поверхности которых находятся антитела к изотипу детектирующихантител. Это связано, во-первых, с различной эффективностью сорбции антител на11сенсорные чипы. Во-вторых, стрептавидин обладает 4 симметрично расположеннымисайтами связывания биотина, поэтому хотя бы один такой сайт на каждой молекуле будетдоступен вне зависимости от её ориентации в процессе иммобилизации на поверхностимагнитных частиц, в отличие от неориентированно иммобилизованных антител, у которыхантиген-распознающие участки могут быть стерически недоступны.
В-третьих, кинетическаяконстанта ассоциации стрептавидина с биотином на несколько порядков выше, чем умоноклональных антител с антигеном. Это обеспечивает более сильное и быстроесвязывание МЧ, покрытых стрептавидином, по сравнению с МЧ, покрытыми антителами.Рисунок 4. Сенсограммы, демонстрирующие все этапы магнитного иммуноанализа набиотинилированной (нижняя зеленая кривая) и эпоксилированной (верхняя красная кривая)поверхностях сенсорного чипа: АТ1 – иммобилизация антител, АГ – связывание антигена (сТнI) симмобилизованными антителами, АТ2 – распознавание детектирующими антителами другогоэпитопа антигена, МЧ – ассоциация магнитных наночастиц с детектирующими антителами.Экспериментально установлены наблюдаемые кинетические константы ассоциации(табл.
1), оцененные для каждого этапа анализа при помощи сенсограмм, регистрируемыхметодом СКИ (рис. 4). Для обеих схем иммобилизации антител на этапе МЧ наблюдаемыекинетические константы ассоциации выше на 2-3 порядка, чем на предыдущих этапах,несмотря на то, что на каждом следующем шаге анализа этот параметр ниже истинногозначения из-за диссоциации комплексов, образованных на предыдущем шаге. Столь хорошиекинетические характеристики связывания МЧ по сравнению с молекулами антител иантигенов, по-видимому, связаны с поливалентностью МЧ.
Несколько биораспознающихмолекул, одновременно связанных с одной частицей, обеспечивают более высокуювероятность эффективного соударения МЧ с поверхностью сенсорного чипа.12Таблица 1. Наблюдаемая кинетическая константа ассоциации для каждого этапа магнитногоиммуноанализа в зависимости от типа поверхностиТип поверхностиНаблюдаемая кинетическая константа ассоциации, M-1c-1Этап АГЭтап АТ25Эпоксилированная(6,4±1,3) × 10Биотинилированная(8,2±1,9) × 105Полученныерезультаты(1,6±0,2) × 108(1,7±0,3) × 105(6,4±1,1) × 107(1,2±0,2) × 10позволяютЭтап МЧ5оцениватькинетическиехарактеристикивзаимодействия биомолекул не только между собой, но и с магнитными частицами.Существенно больший прирост толщины биослоя на этапе пропускания МЧ по сравнению сэтапами связывания антигена и детектирующих антител объясняется тем, что диаметр частиц(50 нм) существенно больше характерных размеров детектируемых биомолекул (10 нм).Получены зависимости прироста биослоя на эпоксилированной поверхности наэтапах пропускания антигена и магнитных наночастиц от концентрации тропонина (рис.
5).По критерию 2σ определен предел детекции сТнI: 20 нг/мл при безметочной регистрации и0,1 нг/мл при использовании МЧ. Таким образом, полученные результаты демонстрируют,что использование МЧ вызывает амплификацию сигнала спектрально-корреляционнойинтерферометрии, что приводит к дополнительному улучшению предела детекциисердечного тропонина более чем в 100 раз.Рисунок 5. Зависимости прироста биослоя на эпоксилированной поверхности сенсорного чипа наэтапах пропускания антигена (правая зеленая кривая) и магнитных наночастиц (левая красная кривая)при регистрации сердечного тропонина I.Четвертая глава посвящена разработке метода магнитного иммуноанализа (МИА)для определения стафилококковых токсинов в сложных средах практически любого объема.Спомощьюметодикиколичественногонаблюдениязавсемишагамиреакции,разработанной в третьей главе, выбраны оптимальные для проведения иммуноанализа парыантител,обладающиенаибольшимотношением13специфическогосигналакнеспецифическому.РазработанныйметодМИАоснованнавысокочувствительнойрегистрации магнитных наночастиц по их нелинейному намагничиванию, причемчувствительность иммуноанализа растет при увеличении объема анализируемых образцов.Представлен метод детекции магнитных наночастиц, используемый для измеренияколичества МЧ, применяемых в качестве маркеров биохимических реакций.
Метод основанна регистрации нелинейного отклика суперпарамагнитных МЧ, помещенных в магнитноеполе, генерируемое на двух частотах f0 и f1. Сигнал, пропорциональный количествумагнитных частиц, регистрируется на комбинаторной частоте f1 ± 2f0 (рис. 6). Пределдетекции МЧ таким методом при комнатной температуре составляет 3 нг магнитногоматериала Fe3O4 в объеме 0,1-0,5 мл, что совпадает с порогом детекции радиоактивногометода по сопутствующему -излучению (Nikitin M. P.
et. al. // J. Appl. Phys. 2008. V. 103.№7. P. 07A304). Линейный диапазон метода составляет 4-5 порядков величины. Данныйметодрегистрациихарактеризуетсявысокимотношениемсигнал/шум,посколькуокружающие диа- и парамагнитные материалы, такие как стекло, вода, компоненты крови ипластик, не вносят вклад в сигнал, даже если их количество в зоне регистрации на 8порядков больше количества МЧ.Рисунок 6. Метод детекции магнитных наночастиц на комбинаторных частотах.В качестве детектируемых токсинов выбраны стафилококковый энтеротоксин А(СЭА) и токсин синдрома тканевого шока (ТСТШ).
Оригинальность подхода заключается врегистрации наномаркеров со всего объема непрозрачных волоконных объемных фильтров,используемых в качестве твердой фазы иммуноанализа. Волокна внутри фильтрапереплетены и преимущественно ориентированы вдоль оси цилиндра. С помощьюсканирующей электронной микроскопии показано, что диаметр отдельного волокнасоставляет 25±4 мкм (рис. 7а). Общая площадь реакционной поверхности составляет около1420 см2 при объеме фильтра около 35 мкл.
В экспериментах использованы фильтры, имеющиепористость 70%. Количество антител, иммобилизованных на одном фильтре, оцененное спомощью метода на основе использования бицинхониновой кислоты, составило 0,9 мкг.Сорбционная емкость фильтров, таким образом, составляет порядка 26 мкг антител на 1 млили 45 нг на 1 см2 твердой фазы.
Фильтры размещаются внутри наконечников, совместимыхсо стандартными пипетками и системами автоматического дозирования реагентов, черезкоторые последовательно пропускаются иммунореагенты (рис. 7б).А)Б)Рисунок 7. Разработанный магнитный иммуноанализ: А) – сканирующая электроннаямикрофотография поверхности волоконного фильтра, общий вид боковой поверхности фильтра (60xувеличение) и увеличенный фрагмент (500x увеличение); Б) – в наконечник для пипетки помещаетсяволоконный 3D фильтр, через который осуществляется иммунофильтрация пробы. Магнитныенаномаркеры регистрируются по их нелинейному отклику в магнитном поле на комбинаторныхчастотах.Проведено определение токсинов СЭА и ТСТШ в двух форматах (рис. 8). В первом изних пропускание образца через твердую фазу осуществлялось циклами с помощью системыавтоматического дозирования.
Цикл дозирования включал в себя забор раствора споследующим его выпуском обратно в ту же емкость, при этом один цикл дозированиядлился 30 сек. В этом формате образцы объемом 150 мкл дозировались в течение 7 мин черезкаждый из 12 наконечников. Данный формат магнитного иммуноанализа был названэкспресс-МИА. Характерное время анализа в этом формате – 25 мин.Во втором формате образец в течение 90 мин прокачивался через фильтр с помощьюавтоматического перистальтического насоса, обеспечивающего прокачку реагентов вшироком диапазоне скоростей от 0,3 мкл/мин до 30 мл/мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
