Разработка методов иммуноанализа с использованием магнитных наномаркеров (1104599), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Динамический диапазон составил около 3 порядковвеличины концентрации. Благодаря высокой чувствительности и широкому динамическомудиапазону, разработанный метод может рассматриваться в качестве привлекательногоинструментасширокодоступнымиинизкозатратнымирасходнымиматериалами(одноразовыми сенсорными чипами) для проведения иммуноанализа в реальном времени втаких областях, как диагностика заболеваний, регистрация патогенов в продуктах питания,мониторинг окружающей среды.Положения, выносимые на защиту1.Наосновеспектрально-корреляционнойинтерферометрииразвитаметодикаколичественной оценки взаимодействия между биомолекулами. Эффективность методикиэкспериментально продемонстрирована на примере исследования влияния пептидногофрагмента (65–76) C-концевого домена моноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1)на взаимодействие MCP-1 с гепарином.2.С помощью спектрально-корреляционной интерферометрии показаны обратимыеизменения конформации привитых на стеклянную поверхность сополимеров N,Nдиметилакриламида и N-акрилоил-m-аминофенилборной кислоты при смене состава водногоокружения.3.Установлено, что магнитные наночастицы диаметром ~ 50 нм, используемые дляамплификации сигнала при детекции сердечного тропонина I с помощью спектральнокорреляционой интерферометрии, вызывают улучшение предела детекции более чем в 100раз по сравнению с безметочной регистрацией.

Показано, что в результате такой6амплификации достигается предел детекции сердечного тропонина I на уровне 0,1 нг/мл идинамический диапазон – около 3 порядков величины концентрации.4.Разработан метод регистрации биомолекул с использованием магнитных наночастиц вкачестве меток, регистрируемых по нелинейному перемагничиванию на комбинаторныхчастотах, с применением в качестве твердой фазы объемных волоконных фильтров сразвитой площадью поверхности. Характерные особенности разработанного методапродемонстрированы на примере определения в цельном молоке стафилококковых токсинов,энтеротоксина А (СЭА) и токсина синдрома тканевого шока (ТСТШ).

Показано, что за счетконцентрирования токсинов на волоконной твердой фазе с иммобилизованными антителамичувствительность метода растет с увеличением объема пробы. При времени анализа 2 ч иобъеме пробы 30 мл достигнут предел детекции для ТСТШ – 4 пг/мл и для СЭА – 10 пг/мл.Установлено, что при времени анализа 25 мин пробы объемом 150 мкл предел детекцииТСТШ составляет 0,1 нг/мл, СЭА – 0,3 нг/мл. Продемонстрирована близкая к линейнойзависимость регистрируемых сигналов от изменения концентрации аналита в диапазонеболее 3 порядков величины.5.Разработан количественный экспресс-метод детекции онкомаркера – простатическогоспецифическогоантигена(ПСА)–всывороткекровичеловеканаосновеиммунохроматографического анализа с использованием магнитных наномаркеров. Показано,что предел количественной детекции ПСА составляет 25 пг/мл, динамический диапазон –более 3 порядков величины концентраций.Апробация результатовРезультаты работы были представлены на 13 российских и международныхконференциях: International Conference on the Scientific and Clinical Applications of MagneticCarriers (Minneapolis, Minnesota, U.S.A., 22-26 May 2012; Rostock, Germany, 25-29 May 2010),European Magnetic Sensors and Actuators Conference (Prague, Czech Republic, 1-4 July 2012;Bodrum, Turkey, 4-7 July 2010), Conference on Optical Chemical Sensors and Biosensors(Barcelona,Spain,1-4April2012;Prague,CzechRepublic,28-31March2010),III Международный Симпозиум «Актуальные проблемы биофотоники – 2011» (СанктПетербург – Нижний Новгород, 16-22 июля 2011), Московский международный симпозиумпо магнетизму (Москва, 21-25 августа 2011), Международный конкурс научных работмолодых ученых в области нанотехнологий RUSNANOTECH (Москва, 26–28 октября 2011;1-3 ноября 2010), Научная конференция МФТИ (Москва-Долгопрудный, 10-30 ноября 2011;27-30 ноября 2009), III Евразийский конгресс «Медицинская физика – 2010» (Москва, 21-25июня 2010).7ПубликацииПо материалам работы опубликовано 5 статей в рецензируемых научных журналах,входящих в список ВАК, и 16 тезисов докладов в сборниках трудов конференций.Структура и объем работыДиссертация состоит из введения, одной главы литературного обзора, четырех главрезультатов и обсуждения экспериментов, заключения, списка цитируемой литературы, вкоторый входит 169 источников.

Работа изложена на 131 странице, содержит 49 рисунков и 5таблиц.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВ первой главе представлен анализ литературных данных об основных методахизучения межмолекулярных взаимодействий и методах детекции, применяемых виммуноанализе, а также методах регистрации магнитных частиц. Представлены сведения отрадиционных методах, основных типах, форматах и количественных характеристикахиммуноанализа.Во второй главе представлены результаты, посвященные разработке и верификацииметода изучения взаимодействий между биомолекулами в режиме реального времени спомощьюспектрально-корреляционнойинтерферометрии(СКИ).Подтвержденаэффективность данного метода путем сравнения полученных с его помощью результатов сданными независимых методов: вискозиметрии, эллипсометрии, иммуноферментногоанализа, сканирующей электронной микроскопии.Приведено описание применяемой в работе биосенсорной системы, основанной напринципе СКИ, позволяющей использовать в качестве расходных сенсорных чиповширокодоступные микроскопные покровные стекла без нанесения каких-либо пленок.

МетодСКИ использует два интерферометра Фабри-Перо в оригинальной оптической схеме сприменением излучения суперлюминисцентных диодов. База первого интерферометра(расстояние между зеркалами) периодически изменяется с помощью пьезоэлектрическогопреобразователя. Роль второго интерферометра и сенсорного чипа выполняет микроскопноепокровное стекло с иммобилизованными на поверхности рецепторными молекулами. Такиестекла при толщине около 100 мкм являются приемлемыми интерферометрами Фабри-Перопри условии, что размер каждой отдельной зоны наблюдения составляет 2-8 мм. Метод СКИиспользует интерференцию между опорным лучом, отраженным от нижней поверхностипокровного стекла, и зондирующим лучом, отраженным от верхней поверхности стекла сбиораспознающими молекулами (рис.

1). В ходе исследуемой биохимической реакции насенсорном чипе происходит присоединение биомолекул из раствора (лигандов) крецепторныммолекулам,чтоувеличивает8оптическийпутьзондирующеголуча,отраженного от границы “жидкость – биослой”. Результат интерференции двух лучейзависит от толщины биологического слоя, изменение которой в ходе реакции вычисляется поизменению фазы корреляционного сигнала при сканировании базы первого интерферометра.Такой принцип регистрации делает результат независимым от объемного показателяпреломления используемых растворов и, соответственно, от температурных зависимостейпоказателя преломления растворов.Рисунок 1.

Принцип спектрально-корреляционной интерферометрии, применяемый для изучениявзаимодействий между биомолекулами. Изменение оптической толщины биослоя регистрируется поспектру интерферирующих лучей, отраженных от сенсорного чипа: 1 – воздух; 2 – покровноемикроскопное стекло; 3 – исследуемый раствор; 4 – проточный сенсорный канал; 5 – рецепторныемолекулы; 6 – падающий луч излучения суперлюминесцентного светодиода; 7, 9 – отраженные лучи;8 – положение отраженного луча до биохимической реакции; 10 – регистрируемые биомолекулы.С помощью метода СКИ обнаружены и исследованы обратимые изменения толщины“полимерных щеток”: сополимеров N,N-диметилакриламида (DMAAm) и N-акрилоил-mаминофенилборной (NAAPBA) кислоты. Установлено, что толщина слоя таких полимеров,иммобилизованных на стеклянной поверхности, увеличивалась на 0,5-1 нм при сменесостава водного окружения с деионизованной воды на бикарбонатный буфер, и вновьуменьшалась при обратной смене растворов (рис.

2Б). Данный эффект, видимо, вызванконформационными изменениями полимеров, являющихся слабыми полиэлектролитами. Вдеионизованной воде незаряженные молекулы принимают неупорядоченную конформациюклубков, в то время как в 0,1 М бикарбонатном буфере (pH 9,2) отрицательно заряженныеостатки фенилборной кислоты, отталкиваясь друг от друга, вызывают “выпрямление”молекул полимера (рис.

2А). Схожее изменение гидродинамического радиуса данныхсополимеров зарегистрировано с помощью независимого метода вискозиметрии. Показано,чтоуглевод-специфичноевзаимодействиеостатковборнойкислотывсоставеDMAAm/NAAPBA сополимера с гликопротеином муцином вызвало дальнейшее увеличениетолщины полимерных щеток на 1,5 ± 0,3 нм (рис. 2В). Установлено, что плотность9иммобилизованного слоя муцина составила 150–200 нг/см2, что в несколько раз превышаетплотность адсорбции муцина на гидрофобные полимерные покрытия.Рисунок 2. Регистрация конформационных изменений полимеров с помощью метода СКИ: А) – схемаизменения конформации сополимеров на стеклянной поверхности при изменении состава водногоокружения и последующего связывания муцина; Б) – сенсограмма, демонстрирующая обратимыеизменения конформации полимера; В) – сенсограмма, демонстрирующая связывание полимера смуцином.Кроме того, с помощью метода СКИ показана возможность количественнойрегистрации взаимодействия между биомолекулами на примере изучения влиянияпептидного фрагмента (65–76) С-концевого домена моноцитарного хемотаксического белка1 (MCP-1) на взаимодействие MCP-1 с гепарином.

Характеристики

Список файлов диссертации