Взаимодействие карбоксиметильных порфиринов с ДНК (1102467), страница 4
Текст из файла (страница 4)
8) соединений с теломерным G-квадруплексом (TelQ). Взаимодействиепорфиринов с G-квадруплексной структурой ДНК можно описать модельюнезависимой посадки нескольких молекул лиганда. Параметры связыванияопределялиаппроксимациейэкспериментальныхизотермуравнением,описывающим модель независимых мест связывания лиганда на G-квадруплексе(Crothers, 1968):nNi KiC fi 11 KiC fr(2)где Cf - концентрация свободного соединения, r - среднее заполнение, Ki –константы связывания, Ni – число мест связывания с i-ой константой на одноймолекуле G-квадруплекса, n – количество типов комплексов.650r/C , 10 MРис. 8.
Изотермы адсорбции порфиринов P1 (○) иP2r/cf (●)на TelQ. Образцы содержат 10мМ Na –P1фосфатный буфер, 100мМ NaCl при t=20°C.Непрерывнойлинией показана аппроксимацияr/cf P2экспериментальных точек, параметры Ki и Nir/cf fit P1приведеныв таблице 6.-1f403020r/cf P21000123rИзотермы связывания соответствуют взаимодействию трех молекул лигандас молекулой TelQ при образовании двух типов комплексов. Определены константысвязывания соединений P1 и P2 с теломерным квадруплексом TelQ приведенные втаблице 6.Таблица. 6. Параметры образования двух типов комплексов порфиринов P1 и P2 сантипараллельным TelQ квадруплексом.K1, 106M-1N1K2, 106M-1N2Р140±61.05.4±0.42.0Р23.1±0.21.01.2±0.22.013Анализ констант связывания порфириновых производных с теломерным Gквадруплексом свидетельствует о том, что наличие у соединения P1 карбоксильныхгрупп обусловливает высокое сродство лиганда к TelQ, квадруплексу; объемныезаместители в боковых группах молекулы P2 ослабляют взаимодействие с Gквадруплексной ДНК.Характеристики мест связывания Р1 и P2, определенные методомфлуоресценции.Спектры флуоресценции молекул порфиринов P1 и P2 в комплексе сантипараллельным квадруплексом (TelQ) регистрировали в условиях малогозаполнения (r ~ 1), когда молекулы исследуемых порфиринов практическиполностью связаны c TelQ (Рис.
9а).Флуоресценция, оеФлуоресценция, оеа160120KCl_P1_4e-5_5ul4FREE1NaCl_P2_4e-5_4ul_4TQ24_P1_NaCl0.8TQ24_P2_4ul Naб0.6P2 in KCl, NaClTQ 1uM, P1 1 uM660nm, 720nm800.40.2400600Рис. 9. (а) СпектрыNa P1флуоресценциисвободного иNa P2адсорбированногона TelQIRFквадруплексе порфирина P1 иP2; (б) Кривые затуханияфлуоресценции порфиринов P1и P2 в комплексе с TelQ: (-)кривая отклика системы (IRF)0650700750Длина волны, нм80055 60 65 70 75 80 85 90Время, нсСпектры флуоресценции свободных и связанных с TelQ порфиринов P1 и P2различаются незначительно.
У адсорбированных молекул возрастает интенсивностьфлуоресценции в полосах с максимумами 660 и 720 нм. Появление болеевыраженных полос флуоресценции указывает на ограничение колебательныхстепеней свободы молекул порфиринов при взаимодействии с TelQ. Наблюдаемыеизменения в спектрах флуоресценции аналогичны обнаруженным ранее изменениямдля комплексов P1 и P2 с АТ-дуплексом ДНК.
Вероятно, адсорбция молекул P1 и P2при малом заполнении (r ≤ 1) происходит в основном на TTA-петлях квадруплекса.Таблица. 7. Длительность флуоресценции комплексов P1 с TelQ в зависимости отзаполнения.τ1, нсa1τ2, нсa2P1 (r=1)0.9±0.10.32±0.058.03±0.070.68±0.02P1 (r=2.5)1.0±0.10.55±0.157.2±0.60.45±0.15Чтобы объяснить природу флуоресценции порфиринов в комплексе с TelQ,изучали кинетику затухания флуоресценции комплексов P1 с TelQ. На рис. 9бприведены кривые затухания флуоресценции порфирина P1 в комплексе с TelQ призаполнении r = 1 и 2.5. Кинетика затухания этих кривых хорошо описываетсябиэкспоненциальным уравнением с коротким и длинным временем жизнифлуоресценции (табл.
7). При повышении концентрации адсорбированного лигандавплоть до r ~ 2 кинетика затухания флуоресценции несколько изменялась.Наблюдали увеличение доли короткоживущей компоненты флуоресценции. Данные14о времени затухания флуоресценции комплексов порфирина с квадруплексомуказывают на наличие двух типов мест связывания. Долгоживущая компонентахарактеризует комплекс с АТ участками квадруплекса, а короткоживущая с Gквартетными участками. При низком заполнении (r ≤ 1) преобладают местасвязывания с TTA петлями (70–80%), при высоком заполнении (r ~ 2) половинаадсорбированных молекул связана с G-квартетами. Эти данные согласуются сизотермами адсорбции для двух типов комплексов. Р2 проявляет схожие свойства вкомплексе с квадруплексом.
Таким образом, уточнена природа двух типовкомплексов производных порфирина Р1 и Р2 с антипараллельным теломернымквадруплексом: первый тип комплексов P1 и P2 с высокими константамисвязывания можно отнести к взаимодействию на TTA-петлях с образованиемдолгоживущей флуоресцирующей компоненты; второй, более слабый комплекс,который является потушенным – к связыванию с G-квартетами.Изменение конформации квадруплексной структуры под действиеммодифицированных порфиринов.Влияние образования комплекса с новыми производными порфирина наконформацию теломерного квадруплекса изучали по спектрам кругового дихроизма(КД) в УФ-области. Спектр КД молекул TelQ (рис.
10) соответствует вторичнойструктуре, образованной сворачиванием олигонуклеотида d(TTAGGG) 4 вантипараллельный G-квадруплекс в присутствии NaCl (рис 10a) и смешанный 3+1G-квадруплекс в присутствии KCl (рис 10б).Образование комплекса с G-квадруплексом в присутствии ионов натрия икалия происходит с некоторыми конформационными изменениями ДНК. Спектр КДTelQ в буфере, содержащем Na+ (рис.10а) соответствует структуре, образованнойсворачиванием d(TTAGGG)4 олигонуклеотида TelQ в антипараллельныйвнутримолекулярный G-квадруплекс состоящий из трех G-квартетов, двух боковыхпетель и одной диагональной петли (Pattel, 2007).
При титровании такого Gквадруплекса молекулами порфиринов наблюдалось уменьшение интенсивностиположительной полосы с максимумом в 295 нм и отрицательной в 265 нм.-14-1-1, M cmа534231201-1-2220 240 260 280 300 320 340Длина волны, нм-1, M cmбNa P1Na P2TQ 100mM NaClРис. 10. Спектры КД TelQсвободногоK_P1(-) и в комплексе сK_P2порфиринамиP1 (○) и P2 (●)TQ_100mMKClфосфатном буфере pH 7.8: (а)100 мМ NaCl (б) 100 мМ KCl0-1-2220 240 260 280 300 320 340Длина волны, нмСледует отметить, что при связывании порфиринов с G-квадруплексом,наведенный сигнал КД в области полосы Соре порфиринов (420 - 480 нм) был15незначительным. Это свидетельствует об отсутствии эффекта наведенногодихроизма в УФ-области.
Таким образом, наблюдаемые изменения спектра КДотражают конформационные перестройки ДНК. Изменения в спектре КДуказывают на частичное разрушение G-квартетов при образовании комплексов смолекулами порфирина.В буфере с KCl спектр КД в присутствии соединений соответствуетструктуре смешанного «3+1» G-квадруплекса, в котором три блока гуаниновпараллельны друг другу, а один антипараллелен.
При этом блоки соединены двумябоковыми ТТА петлями и одной «пропеллерной» петлей, переворачивающейнаправление блоков гуанина. В присутствии ионов K+ связывание молекулпорфиринов приводит к уменьшению интенсивности полосы в 295нм и увеличениюинтенсивности положительной полосы в 265 нм (Рис. 10б).
В этом случаеизменение конформации ДНК при связывании лиганда можно объяснить такжеразрушением одного квартета. В структуре смешанного «3+1» квадруплекса каждыедва квартета имеют либо одинаковую, либо противоположную ориентацию (Gray,2008). Разрушение квартета около 5’-конца квадруплекса приведет к потерестекинга квартетов с разной ориентацией. Положительная полоса в 265 нмубедительно выявляет стекинг гуаниновых квартетов с одинаковой ориентацией.Таким образом, структура квадруплекса в комплексе с двумя молекулами лигандасодержит два квартета в одинаковой полярности.-1M cm4-1-1P1 with TQ24 in NaClа241.0M cm-1P1 with TQ24 in NaClб22.03.000-25.014.619.223.8-428.3-62.09.814.619.2-41.03.05.09.8-2-23.828.332.7-6220 240 260 280 300 320 340Длина волны, нм32.7220 240 260 280 300 320 340Длина волны, нмРис.11.
Спектры КД TelQ при образовании комплексов с порфириновыми производными (а) ZnP1, (б) - NiP1Наличие металлов в порфириновом макроцикле незначительно влияет нааффинность соединений к теломерному G-квадруплексу. Данные КД (Рис. 11)позволяют выявить структурные перестройки, происходящие при образованиикомплекса металлопорфиринов с ДНК. При взаимодействии с ZnP1 спектр КДпрактически не меняется (Рис. 11а). Связывание с порфирином NiP1, напротив,приводит к значительному изменению спектра КД (Рис. 11б). Наблюдаетсяуменьшение амплитуды как положительной полосы в 295 нм, так и отрицательной в265 нм. При взаимодействии с соединением NiP1 положение максимума 295 нмположительной полосы КД смещается в 290 нм.
Спектр наведенного круговогодихроизма становится похож на КД-спектр дуплекса ДНК в комплексе с16интеркалятором, что говорит о возможном образовании шпильки привзаимодействии квадруплекса с лигандом NiP1. Аналогичный спектр наблюдалсядля неквадруплексной структуры, образованной мутантной теломернойпоследовательностью d(TTAGGGTTAGAGTTAGGGTTAGGG) в комплексе спорфирином NiP1. Таким образом, NiP1 вызывает значительное изменениеструктуры G-квадруплекса с перестройкой в шпилечную структуру с не-уотсонкриковскими GG парами оснований.Термостабильность теломерного квадруплекса в комплексе с порфиринами.Методом плавления по FRET исследована стабилизация теломерного Gквадруплекса Gtel22-DA (FAM-5’-d(AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG)-3’-BHQ1)и конкуренция за связывание с лигандом между G-квадруплексной структуройGtel22-DA и двойной спиралью ДНК (Mergny, 2005).
В качестве модели двойнойспирали ДНК была выбрана шпилька, образованная самокомплементарнымолигонуклеотидом ds26 5'-d(CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG)-3’.Высокую стабилизацию квадруплекса наблюдали в присутствии порфиринов.Порфирины P1 и NiP1– увеличивали температуру плавления квадруплекса на 25°С;P2 и ZnP1 стабилизировали квадруплекс в меньшей степени - примерно на 15°С(рис 12). Различия в стабилизации квадруплекса хорошо коррелируют сконстантами связывания порфиринов с G-квадруплесным олигонуклеотидом.Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
