Взаимодействие карбоксиметильных порфиринов с ДНК (1102467), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Список литературы включает 153 наименования.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫПервая глава посвящена анализу литературных данных о разнообразииструктур ДНК, в частности, о неканонической структуре G–квадруплекса, изучениюконформационных особенностей этих структур, определяющих направленныйпоиск противоопухолевых препаратов. Рассмотрена имеющаяся информация опорфириновых производных, на основании чего определены перспективы5использования соединений данного ряда в качестве высокоспецифичных лигандов кнеканоническим структурам ДНК, а также в качестве фотосенсибилизатора дляфотодинамической терапии опухолей.Вторая глава посвящена описанию материалов, инструментов и методовопределения механизмов взаимодействия карбоксиметильных порфиринов с ДНК.Для проведения исследования использовались новые карбоксиметильныепроизводныепорфирина:5,10,15,20-тетракис(N-карбоксиметил-4пиридиний)порфирин(P1),5,10,15,20-тетракис(N-этоксикарбонилметил-4пиридиний)порфирин (P2) синтезированные в ИГХТУ (Березин, 2007), а такжемодификации P1, заключающиеся в координировании ионов Zn(II) или Ni(II) в ядропорфиринового макроцикла полученные в ИНЭОС РАН (Kovaleva, 2014) (схема 1).P1P2NiP1ZnP1RCH2COOHCH2COOC2H5CH2COOHCH2COOHСхема1.Структурапроизводных порфирина.MH2H2Ni(II)Zn(II)исследуемыхВ качестве модельных ДНК были выбраны ДНК тимуса теленка (ctDNA)(Sigma-Aldrich, США), олигонуклеотиды d(AT)20 и d(GC)20 (“Литех”, Россия),последовательность теломерного G-квадруплекса d(TTAGGG)4, (“Синтол”, Россия).Описаны методы спектроскопии, флуоресцентного анализа и круговогодихроизма, с помощью которых охарактеризованы комплексы производныхпорфирина с ДНК различной структуры и последовательности.
Генерация активныхформ кислорода модифицированными соединениями определена по деградации 1,3дифенилизобензофурана. Фотоповреждение ДНК (одно – и двунитевые разрывы)установлено по изменению электрофоретической подвижности в 1% агарозном гелеплазмиды pBR322, (Fermentas). Действие порфириновых производных набиологические объекты апробировано на ряде опухолевых клеток HCT116, K562,MCF7 и HeLa.В третьей главе рассмотрена двойная спираль ДНК в качестве мишени длякарбоксиметильных порфиринов и металлопорфиринов.Аффинность новых производных порфирина к различным участкам двойнойспирали ДНК.Для определения термодинамических параметров образования комплексовпорфиринов с дуплексами, имеющими заданный AT- и GC-состав, были построены6изотермы адсорбции этих лигандов на ДНК (Рис.1 а, б).
Поспектрофотометрическим данным построены изотермы адсорбции в координатахСкетчарда как r/Cf от r, где r есть среднее заполнение ДНК лигандом, т.е.количество связавшегося лиганда в расчете на пару оснований, Cf - концентрациясвободного лиганда. Форма изотерм адсорбции обнаруживает антикооперативныймеханизм взаимодействия порфиринов P1 и P2 с ДНК, характерный для комплексовпротяженных лигандов с двойной спиралью ДНК.530r/C , 10 M5-1P1 GCFit ValuesP1 ct DNAFit ValuesP1 ATfа253r/C , 10 M-1P2 GCFit ValuesP2 ct DNAFit ValuesP2 ATfб2.5202y = m2*(1-m1*m0)^m1/(1-(m1-1...15105Error1.95670.21499m22.97180.391461ChisqR1.43290.88605NANA0.50y = m2*(1-m1*m0)^m1/(1-(m1-1...1.5Valuem1Value1.88530.33932m20.927090.16087ChisqR0.168290.75237NANA000.10.20.30.40.500.1r0.20.30.40.5rРис.
1. Изотермы связывания порфиринов P1 и P2 с ДНК различного нуклеотидного состава,построенные по изменению спектров поглощения лигандов при титровании ДНК: ctDNA (●),GC-дуплекс (○), AT-дуплекс (▲). На рисунке (а) – P1, (б) – P2.rCf1 n rK (1 n r )1 (n r ) r(n r )(1)Аппроксимация экспериментальных изотерм адсорбции уравнением (1),описывающим взаимодействие протяженного лиганда с бесконечной линейнойматрицей (Заседателев, 1971), позволила определить константы связывания и длинуместа связывания лиганда на матрице ДНК (Таблица 1). Видно, что более объемнаябоковая группа соединения P2 на периферии макроцикла уменьшает сродствопорфириновых производных к ДНК по сравнению с порфирином P1.
Анализконстант связывания на ДНК различной последовательности показалпредпочтительное взаимодействие порфиринов с GC-дуплексом по сравнению сАТ-дуплексом ДНК.Таблица. 1. Характеристики образования комплексов порфиринов P1 и P2 с ДНК различногонуклеотидного состава.ctDNAGC-дуплексAT-дуплексK, 105M-1N, поK, 105M-1N, поK, 105M-1N, поP1P234.1±2.02.8±0.22.7±0.22.2±0.121.1±0.62.1±0.13.0±0.11.9±0.13.0±0.41.0±0.22.0±0.21.9±0.3Определены параметры связывания металлопорфиринов NiP1 и ZnP1 с ДНКтимусателенка.Обнаруженантикооперативныйхарактерсвязыванияметаллопорфиринов NiP1 и ZnP1 с двойной спиралью ДНК (Рис.2). Определены7Errom1константы связывания и длина места связывания лиганда, выраженная в парахнуклеотидов, на матрице ДНК (таблица 2).
Оказалось, что ион металла в ядрепорфиринового макроцикла незначительно влияет на аффинность соединений кдвойной спирали ДНК. При взаимодействии металлопорфиринов с ДНКнаблюдается более плотная посадка при среднем заполнении приблизительно двепары нуклеотидов на одну молекулу лиганда.535r/C , 10 MТаблица. 2.
Характеристикиобразования комплексов P1, ZnP1 иNiP1 с ДНК тимуса теленка.-1fP1 ct DNAR/C1 Nir/cf ZnFit Values30P125ZnP1y = m2*(1-m1*m0)^m1/(1-(m1-1...20m1NiP1m215ChisqR10ValueError1.79928.95810.4330.976320.0990972.2165NANAy = m2*(1-m1*m0)^m1/(1-(m1-1...5000.10.2r0.30.4P1NiP1ZnP1ValueErrorm11.66550.20295m28.06181.4683Chisq1.0696NAR0.93856NA0.5K, 105M-134±229±28±5N, по2.7±0.21.8±0.11.6±0.3Рис. 2. Изотермы связывания P1, ZnP1 и NiP1 стимусной ДНК: P1(○), NiP1(▲), ZnP1(●).Типы комплексов порфиринов с двойной спиралью ДНК.По спектрам кругового дихроизма (КД) порфиринов с ДНКохарактеризованы типы образующихся комплексов.
Знак наведенного круговогодихроизма порфиринов в полосе Соре характеризует тип посадки молекул надвойной спирали ДНК (Pasternack, 2003). Данные КД свидетельствуют о том, чтосоединение P1 связывается по бороздке на AT-дуплексе; а на GC-дуплексе –интеркалирует (Рис. 3а). Взаимодействие с тимусной ДНК смешанного AT, GCсостава приводит к образованию комплексов двух типов и характеризуетсяналичием положительной и отрицательной полос в спектре КД (Рис. 3а, (●)).Соединение P2 в комплексе с дуплексом обладает аналогичными характеристиками.Внедрение металла в ядро порфиринового макроцикла влияет на тип комплекса сДНК.
Ион Zn(II) делает соединение бороздочным лигандом, в то время как ионNi(II) – интеркалятором (Рис. 3б).-1-1-1, M cm10а20-1, M cmбP1 AT 3 uMP1 GC5P1 ctDNAATP1 ctDNAP1NiP1Zn100ctDNA0-5GC-10400-10420440460Длина волны, нм480400420440460Длина волны, нм480Рис. 3. (а) – спектры КД комплексов P1 с ДНК тимуса теленка (●), AT-дуплекс (▲), GCдуплекс (■); (б) – КД спектры комплексов пофиринов NiP1(▲), ZnP1(●), P1(○) с ctDNA.8Флуоресцентные характеристики комплексов порфиринов P1 и P2 с ДНКразличной последовательности.Комплексы изучаемых порфириновых производных с ДНК обладаютразличными флуоресцентнымихарактеристиками, которые зависят отнуклеотидного состава участков связывания (Рис.4).
Интенсивность полос спектровфлуоресценции порфиринов P1 и P2 при связывании с тимусной ДНК малоотличается от интенсивности спектров флуоресценции свободного лиганда. В то жевремя происходит значительное изменение формы спектра флуоресценции:6Флуоресценция, оеа6Флуоресценция, ое554433 P1_GC22110600650700750Длина волны, нм800Рис. 4. Нормированные спектрыфлуоресценцииФлуоресценция, оеадсорбированных на ДНК иP2_ctDNAсвободныхпорфиринов (а) – P1,(б) – P2: (○) флуоресценцияP2_GCсвободных порфиринов; (●) – вкомплексе с ctDNA; (■) – вP2_AT1комплексе с GC-дуплексом; (▲)– в комплексе с AT-дуплексом.P2_FreeбФлуоресценция, оеP1_FreeP1_ctDNAP1_AT0600650700750Длина волны, нм800наблюдается перераспределение интенсивности флуоресценции между полосами надлинах волн 655 нм и 715 нм. Появление более выраженных максимумов в спектрефлуоресценции характеризует ограничение колебательных степеней свободыфлуорофоров при связывании с ДНК.При адсорбции порфиринов P1 и P2 на GC-дуплексе происходит образованиеслабо флуоресцирующего комплекса.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
