Взаимодействие карбоксиметильных порфиринов с ДНК (1102467), страница 5
Текст из файла (страница 5)
12. Увеличение температуры плавлениякомплексов TelQ22-DA с порфиринами P1, P2, NiP1,ZnP1ивытеснениелигандаувеличениемконцентрации альтернативной мишени связывания –шпилечной структуры ДНК ds26 (0; 0.2; 0.9 и2.5 мкМ(олигонуклеотидов).201/2T , °C30100P1P2ZnP1NiP1Плавление квадруплексной структуры, стабилизированной порфиринами, вприсутствии двойной спирали ДНК позволяет оценить избирательность связыванияна G-квадруплексной структуре. Наибольшей предпочтительностью связывания наG-квадруплексе по сравнению со связыванием на дуплексе обладают P2, ZnP1.Таким образом, для исследованных модификаций порфиринов за увеличениеизбирательности к квадруплексу ответственно не повышение сродства кквадруплексу, а снижение сродства к дуплексу.Пятая глава посвящена исследованию действия тетракарбоксиметильныхпорфиринов на опухолевые клетки.
Данная часть работы выполнена лично авторомв Лаборатории механизмов гибели клеток Федерального государственногобюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. Н. Н.Блохина» Российской академии медицинских наук.17Нормированноеколичество клетокИсследования темновой токсичности порфиринов с использованием анализаоценки жизнеспособности клеток по определению активности дегидрогеназымитохондрий (MTT-теста) на ряде линий опухолевых клеток: HCT116, K562, MCF7и HeLa – показали низкую цитотоксичность данных соединений. Концентрациясоединения, при которой погибала половина клеток (IC50) была более 50мкМ.Дальнейшие результаты получены анализом сравнения темнового и световогодействия соединений на клеточную линию HeLa.Фрагментация клеточной ДНК под действием света в присутствиикарбоксиметильных порфиринов.Методом проточной цитометрии изучено действие порфиринов P1, ZnP1,NiP1 на содержание ДНК в клетках линии HeLa, не подвергнутых облучениюсветом и инкубированных после облучения.
Клетки HeLa (1,5х106 в 3 млкультуральной среды) рассеивали в чашки Петри. Затем прикрепленные клеткиинкубировали в течение часа в присутствии соединений при концентрации 50мкМ.После воздействия белого света галогеновой лампы мощностью 1,7 J/см2 клеткиинкубировали в течение суток. Для проведения анализа содержания ДНК, клеткилизировали буфером, содержащим иодид пропидия, который окрашивал ДНК влизированных клетках. Полученный лизат клеток анализировали на проточномцитофлуориметре. Результат анализа представлен на рис.
13.Свет+ P1Свет+ NiP1Свет+ ZnP1Флуоресценция иодида пропидия, оеРис.13. Распределение клеток HeLa по содержанию ДНК. Профили гистограмм клеток,инкубированных без соединений, и клеток, инкубированных в присутствии 50мкМсоединений без облучения светом, совпадают. Гистограммы клеток, подвергнутыхоблучению в течение 20мин в присутствии порфиринов, и инкубированные сутки послеоблучения указывают на наличие в них фрагментированной ДНК.По флуоресценции иодида пропидия установлено распределение клеток пофазам клеточного цикла (Лобанов, 2013).
Определено, что без облучения светомсоединения не влияют на соотношение фаз клеточного цикла. Обнаружено, что поддействием света соединения P1 и ZnP1 вызывают появление клеток в sub g1 фазе,что соответствует клеткам с фрагментированной ДНК. Определена доля клеток сфрагментированной ДНК (рис 14).
Оказалось, что соединение ZnP1 в концентрации50мкМ при облучении белым светом приводит к появлению около 50% клеток с18фрагментированной ДНК, в то время как для соединения P1 около 30%. СоединениеNiP1 не вызывало заметной фрагментации ДНК в клетках.Рис.14. Диаграмма зависимости доликлеток с фрагментированной ДНК в ядре(белым обозначены клетки, подвергнутыеосвещению белым светом, черным цветомобозначены клетки, инкубированные вотсутствие света).Sub-G1(%)60DarkLite50403020100Контроль P1ZnP1NiP1Наблюдаемая фрагментация ДНК может быть связана как с её прямымповреждением, так и с отложенным действием, вызываемым запуском процессаапоптотической гибели клеток.
Следует отметить, что анализ содержания ДНК вклетках в течение часа после освещения не показал появления sub g1 фазы,характерной для клеток с фрагментированной ДНК. Это дает основание заключить,что соединения ZnP1, P1 вызывают отложенную фрагментацию ДНК, характернуюдля апоптотического пути гибели клеток.Появление расщепленной формы поли(АДФ)рибозополимеразы в ответ наповреждение ДНК.Деградация ДНК, характерная при запуске процесса апоптотической гибеликлеток, может в частности осуществляться доставленными в ядро клетки исвязавшимися с ДНК молекулами лиганда посредством генерации активных формкислорода, разрушающих нуклеиновую кислоту.
В ответ на значительноеповреждение ДНК, возникает гиперэкспрессия белка позднего апоптоза PARP.Рис. 15. Вестерн блот расщепленной поли(АДФ)рибозополимеразы (PARP) выделенной изклеток после освещения в присутствии порфиринов.Известно, что расщепление белка PARP каспазами на ранней стадии апоптозаотделяет ДНК-связывающий домен от каталитического, таким образом инактивируяфермент. Он перестает выполнять функцию репарации. ДНК-связывающийфрагмент, образуя комплекс с межнуклеосомной ДНК, препятствует доступуферментов репарации к участку повреждения.
Достоверным подтверждениемапоптотической гибели клеток считается рост концентрации инактивированной,расщепленной формы белка PARP. Мы провели соответствующий тест на линииклеток HeLa. Его результаты показаны на рис. 15. Полученные данныесвидетельствуют о том, что в присутствии порфиринов и под действием светазначительно увеличивается концентрация расщепленной формы белка PARP для19соединения ZnP1, что характеризует запуск апоптотического пути гибелиопухолевых клеток (Лобанов, 2013).Выявление механизма гибели опухолевых клеток.Для ZnP1, проявляющего наиболее выраженную активность, методомпроточной цитофлуориметрии была исследованна концентрационная зависимостьсоотношения путей гибели клеток линии HeLa.Дифференцирование типа гибели клеток определяли по степениодновременного прокрашивания клеток анексином-V и иодидом пропидия(Лобанов, 2013).
По специфическому связыванию анексина V/FITC сфосфотидилсерином, который появляется на поверхности апоптотических клеток,определяли ранний апоптоз. По окрашиванию иодидом пропидия определялиналичие клеток с повреждениями мембраны, через которые пропидий проникает вклетку и окрашивает ДНК. Такой тип клеток можно отнести к клеткам позднихстадий апоптоза или к некротическим клеткам.100Доля клеток, %а1008080606040402020Доля клеток, %ÆèâûåÀïîïòîçÍåêðîç/ïîçäíèé àïîïòîçбApoptosis (%)Necrosis/Late apoptosis (%)0Контроль 10 mkM 25 mkM 50 mkM0Live(%)Контроль 10 mkM 25 mkM 50 mkMРис.16.ДиаграммаÆèâûåзависимостидолиÀïîïòîçÍåêðîç/ïîçäíèé àïîïòîçапоптотических (×),некротических (█)иживых (□) клеток HeLa отконцентрации ZnP1: (а) – вApoptosisсвета(%)отсутствиии (б) – поддействиембелогосветаNecrosis/Late apoptosis (%)галогеновой лампы.Live (%)Обнаружена прямая зависимость типа гибели клеток от концентрациипорфирина ZnP1 (Рис 16).
Следует отметить, что доля неповрежденных клеток(белые столбики) после освещения клеток значительно меньше, чем без освещения.После действия света, менее 10 мкМ порфирина ZnP1 необходимо для уменьшениячисла неповрежденных клеток в 2 раза, в то время как без освещения около 50 мкМ.Полученные данные согласуются с результатами МТТ-теста на разных клеточныхлиниях без освещения клеток. Без облучения светом через сутки после добавлениясоединений главным образом наблюдается повреждение клеточной мембраны,которое имеет большой потенциал для восстановления.
Поэтому МТТ-тест, имеявремя инкубации трое суток, не показывает значительной гибели клеток. Напротив,после облучения светом, наблюдалась значительная доля клеток, проявляющихапоптотическую гибель. При высоких концентрациях соединения ZnP1 доляапоптотических клеток, прокрашенных только анексином V/FITC, достигает 60%.Обобщая полученные результаты можно сказать, что порфириновыесоединения могут взаимодействовать с ДНК, под действием света способныгенерировать активные формы кислорода, которые вызывают повреждения ДНК,что инициирует апоптотический путь клеточной гибели.20РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ1.
Установлено, что константа связывания с ДНК у карбоксиметильногопорфирина P1 (K=3.4×106M-1) на порядок выше, чем у этоксикарбонилметильногопроизводного P2. Впервые показано, что карбоксильные группы заместителя впорфирине P1 обусловливают предпочтительные взаимодействия порфирина P1 сGC-богатыми участками ДНК. Порфириновые производные связываются на GCучастках ДНК по интеркаляционному механизму и образуют бороздочныйкомплекс на участках ДНК, богатых АТ парами.2. Выявлена зависимость характера взаимодействия металлопорфиринов сДНК от координированного металла. NiP1 интеркалирует в двойную спираль ДНК,а ZnP1 связывается в бороздке.
Впервые установлено, что тип комплекса ДНКметаллопорфирин играет решающую роль при фотоповреждении ДНК:бороздочныйлигандZnP1индуцируетбóльшиеповреждения,чеминтеркалирующий NiP1.3. Обнаружено высокое сродство изученных тетракарбоксиметильныхпроизводных порфиринов P1, P2, ZnP1, NiP1 к G-квадруплексным участкам ДНК.Предпочтительность порфиринов P2 и ZnP1 к G-квадруплексу определяетсяменьшим сродством к дуплексу ДНК.4. Впервые обнаружены и охарактеризованы структурные изменениятеломерного G-квадруплекса при образовании комплексов с порфиринами: NiP1переводит теломерный G-квадруплекс в шпильку, безметальный порфирин P1вызывает частичное нарушение стекинга одного из квартетов, при этомстабилизируя свернутую структуру G-квадруплекса.
Порфирин ZnP1 не приводит кструктурным изменениям теломерного G-квадруплекса.5. Установлено, что фотоповреждение ДНК под действием ZnP1сопровождается гибелью клеток преимущественно по пути апоптоза.21СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1.2.3.Kovaleva O., Tsvetkov V., Mamaeva O., Ol’shevskaya V., Makarenkov A., Dezhenkova L.,Semeikin A., Borisova O., Shtil A., Shchyolkina A., Kaluzhny D. Preferential DNAphotocleavage potency of Zn(II) over Ni(II) derivatives of carboxymethyl tetracationicporphyrin: the role of the mode of binding to DNA // European Biophysics Journal — 2014.— C.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
