Взаимодействие карбоксиметильных порфиринов с ДНК (1102467), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Это характерно для лигандов-интеркаляторов,которые тушатся гуанином при образовании комплекса с переносом заряда. Привзаимодействии соединений с АТ-дуплексом интенсивность флуоресценциилигандов увеличивается в 5-6 раз относительно свободного соединения.Квантовый выход и длительность флуоресценции комплексов порфиринов P1 сДНК.Абсолютный квантовый выход флуоресценции молекул порфирина P1 (qо)определен по отношению к известному квантовому выходу флуоресценциикарбоксифлуоресцеина и составляет qо = 0.0093. Определены значения квантовыхвыходов флуоресценции порфирина P1 в комплексе с ДНК различногонуклеотидного состава (q) (таблица 3).Таблица.
3. Длительность и квантовый выход флуоресценции свободных порфиринов врастворе и в комплексе с ДНК различного нуклеотидного состава.τ1, нсa1τ1/τoτ2, нсa2τ2/τoq/qoСвободный4.811.001AT дуплекс1012.082.2GC дуплекс0.70.650.155.30.351.100.28ctDNA0.70.470.15100.532.080.859Видно, что при связывании с ДНК смешанного нуклеотидного составаквантовый выход флуоресценции комплексов изменяется незначительно. Величинаотносительного квантового выхода (q/qo) порфирина в комплексе с AT-дуплексомувеличивается примерно в 2 раза, а в комплексе с GC-дуплексом уменьшается в 3.5раза. На основании данных о квантовом выходе флуоресценции сделан вывод о том,что образование комплекса порфирина P1 с GC-парами в значительной степениприводит к тушению флуоресценции.
Аналогичные результаты получены для P2.Для выяснения природы тушения и разгорания флуоресценции порфириновпри взаимодействии с ДНК различного нуклеотидного состава изучена кинетиказатухания флуоресценции (рис. 5). Условия эксперимента были подобраны так, чтоконцентрация адсорбированного лиганда соответствовала среднему заполнениюr=0.04-0.05, при этом концентрация свободного лиганда P1 не превышала 2%.Характеристика кривых затухания флуоресценции получена деконволюциейэкспериментальных кривых и аппроксимацией одно- или двух-экспоненциальнымуравнением затухания. Рассчитанные времена затухания флуоресценции первой ивторой компоненты (τ1 и τ2) и доли этих компонент (a1 и а2), зависящие отконцентрации флуоресцирующих молекул каждой компоненты, приведены втаблице 3.
Для сравнения с квантовым выходом флуоресценции (q/qo) в таблице 3дополнительно приведены значения τi/τо этих комплексов, рассчитанныеотносительно τо свободного лиганда в растворе.Флуоресценция, ое10.80.60.40.2Рис. 5. Кривые затухания флуоресценцииФлуоресценция,оепорфиринаP1 в свободномсостоянии и ваp1 freeкомплексе с ДНК: непрерывная кривая –p1 Ctdna отклик прибора (IRF); (○) флуоресценциясвободного соединения; (●) ctDNA; (▲) GCP1 GCдуплекс; (■) AT-дуплекс. ИнтенсивностивмаксимумекривыхP1 AT флуоресценциизатухания приняты за единицу.IRF055 60 65 70 75 80 85 90Время, нсВремена жизни возбужденных состояний свободных молекул P1 и P2 неразличаются в пределах ошибки эксперимента, τо=4.8±0.1 нс и τо=4.6±0.1 нс,соответственно.Кривые затухания флуоресценции порфиринов, связанных с АТ-дуплексом,хорошо описываются одной экспонентой.
Время жизни флуоресценции (τ)увеличивается приблизительно в два раза относительно τo свободных молекулпорфиринов, и соответствует 10±0.2 нс для порфирина P1 и 8.6±0.1 нс дляпорфирина P2. Возрастание времени жизни флуоресценции в два раза коррелирует сувеличением квантового выхода флуоресценции и объясняется ограничениемколебательных степеней свободы адсорбированных флуорофорофоров и ихэкранированием от молекул растворителя.10Кривые затухания флуоресценции комплексов порфиринов с GC-дуплексомхорошо описываются двухэкспоненциальным уравнением. Время затуханиякороткоживущей компоненты комплексов порфиринов P1 и P2 с GC-дуплексомравно τ1P1=0.7±0.1 нс и τ1P2=0.6±0.1 нс соответственно, и характеризуется высокимвесовым коэффициентом содержания короткоживущей компоненты (60-65%).Время жизни долгоживущей компоненты затухания флуоресценции (τ2)порфиринов P1 и P2, адсорбированных на GC-дуплексе (5.3 нс и 4.2 нс,соответственно), близко к τо свободных лигандов в растворе.
Появлениекороткоживущей компоненты свидетельствует в пользу модели интеркаляционногокомплекса с переносом заряда между GC-парой и интеркалированным порфирином.Кривые затухания флуоресценции порфиринов при взаимодействии с ДНКтимуса теленка характеризуются наличием двух типов комплексов. Однакомпонента имеет короткое время жизни флуоресценции (0.7 и 0.6 нссоответственно), что не противоречит взаимодействию лиганда с GC-участкамиДНК и образованию комплекса с переносом заряда. Долгоживущие компонентыкривых затухания флуоресценции порфиринов P1 и P2 на тимусной ДНКхарактеризуются временем жизни флуоресценции τ2P1=10 нс и τ2P2=8 нс,соответственно и совпадают со временем жизни флуоресценции τ комплексовпорфиринов с АТ-дуплексом (см.
Табл. 3). Несмотря на то, что вероятностьтандемного расположения GC богатых участков относительно мала, более высокаяконстанта связывания именно с такими участками объясняет примерно одинаковыйвес двух компонентов комплексов на тимусной ДНК.Таким образом, флуоресцентные характеристики порфиринов различаютсяпри связывании с участками ДНК различной последовательности, что определяетгетерогенный тип связывания порфиринов с ДНК смешанной последовательности.Фоторазрушение двойной спирали ДНК.Исследуемые соединения являются перспективными для фотодинамическойтерапии (ФДТ) онкологических заболеваний, ключевую роль в которой играютактивные формы кислорода. Генерация модифицированными соединениямиактивных форм кислорода определена по деградации 1,3-дифенилизобензофурана(DPBF) в присутствии порфиринов под действием света в растворедиметилсульфоксида (ДМСО) (Рис.6).
Раствор ДМСО, содержащий DPBF (25 мкМ)и порфирин (1 мкМ) облучали в течение 20 мин белым светом с использованиемгалогенной лампы (Zhang, 2005).На рис. 6 представлены нормированные кривые фотодеградации DPBF.Характерное время деградации DPBF (τ) определено аппроксимациейэкспериментальных зависимостей уравнением ABS=e -t/τ, где ABS – поглощениеDPBF при облучении образца в течение времени t. Таблица 4 характеризуетспособность соединений разрушать DPBF. Явным преимуществом обладаютсоединения P1 и ZnP1. Отметим, что скорость деградации DPBF пропорциональна11молярному поглощению порфириновых соединений.1Поглощение DPBF в 415 нмТаблица.
4. Характерное времядеградации DPBF (τ).Экспериментальные данныеПорфиринВремя τ,мин.аNiP127.0±1.3P15.4±0.1ZnP18.1±0.3Без201.0±5.6порфириновy = exp(-m0/m1)0.8m10.6y = exp(-m0/m1)ValueError27.027 1.2819Chisq0.0028338NAR0.99077NAValueErrorm15.39220.10988ChisqR0.000426420.99968NANAy = exp(-m0/m1)0.40.2ValueErrorm18.11660.29798ChisqR0.00198640.99811NANAy = exp(-m0/m1)Value0m1051015Время освещения, мин20RError201.01 5.6348Chisq 4.9426e-050.99518NANAРис. 6.
Фотодеградация DPBF в присутствии порфиринов▲ – NiP1, ■ – ZnP 1, ○ – P1, □ – Без порфиринов.NiP1P1ZnP1DPBF (Free)Так как исследуемые порфирины способны взаимодействовать с ДНК иявляются генераторами активных форм кислорода под действием света, изученавозможность фотодинамического повреждения двойной спирали ДНК.Фотоповреждение ДНК изучили на кольцевой замкнутой ДНК (плазмида pBR322).Несмотря на сравнимую способность соединений P1 и ZnP1 генерироватьсинглетный кислород, оказалось, что эти соединения качественно по-разномуразрушают ДНК под действием света (Рис.7).Релаксированная плазмида1CэфZnP1P1Zn=0.12 MNi0.80.6CефP1=0.32 My = .14+(1-10.4мкМVm10.1Chisq 0.000.2CэфNiP1=3.7 MR0.9y = .14+(1-1000.20.40.60.81Концентрация порфирина, M.Рис.
7. Зависимость фоторазрушения плазмиды pBR322 от концентрации порфиринов: слева– агарозный 1% гель плазмиды pBR322 облученной белым светом в присутствии различнойконцентрации порфиринов. справа – зависимость релаксированной формы плазмиды отконцентрации порфиринов.Нативная плазмида находится в суперскрученной форме. При поврежденииодной из нитей плазмида релаксирует и переходит в открытую кольцевую форму.При повреждении обеих нитей ДНК плазмида переходит в линейную форму.
Послеосвещения образцов плазмиды в течение часа в присутствии порфириновподвижность плазмиды изменяется. Расположение полос плазмиды в присутствииNiP1 аналогично их расположению в контроле, что указывает на то, что соединениене приводит к изменениям формы плазмиды. P1 и ZnP1 переводят плазмиду воткрытую кольцевую форму. Эффективная концентрация соединения, необходимаядля фоторазрушения 50% плазмиды, приведена на рис. 7. Несмотря на большуюконстанту связывания, в присутствии соединения P1 наблюдаются меньшие12m1ChisqR0.0повреждения, чем с соединением ZnP1, в то время как соединение NiP1практически не изменяет суперскрученной формы плазмиды. Наибольшаяактивность металлопорфирина ZnP1 при разрушении ДНК под действием света,видимо, связана с геометрией комплекса и большей доступностью молекулы ZnP1растворителю при расположении металлопорфирина в бороздке ДНК.В четвертой главе описаны механизмы образования комплексовкарбоксиметильных порфиринов с G-квадруплексами ДНК.Изотермы адсорбции P1 и P2 на антипараллельном теломерном квадруплексе.По спектрофотометрическим данным получены изотермы связывания(Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
