Диссертация (1102290), страница 6
Текст из файла (страница 6)
В вакуумной установке производят испарениеметалла, при котором атомы металла разлетаются по прямым траекториям.Сталкиваясь с объектом, атомы осаждаются на нем, и в месте нахождения объектаобразуются “тени”. Напыленная часть объекта оказывается толще напыленнойподложки (фона), и в результате объект становится видимым. Однаконедостатком такого метода является увеличение размеров объекта на толщинунапыленного слоя, вследствие чего экспериментатор получает информацию лишьо внешнем виде объектов.Другой способ визуализации биологических объектов – негативноеконтрастирование растворами солей тяжелых металлов.
Впервые успешность этойметодики была продемонстрирована Brenner и Horne еще в 1959 году [67]. Вданном случае наиболее часто применяют уранилацетат, молибденовокислыйаммоний, фосфорновольфрамовую кислоту. Поступают обычно следующимобразом: раствор с биологическим объектом смешивают с контрастерами инаносятнапленку-подложку.Привысыханиибиологическиеобъектыоказываются погруженными в тонкий слой аморфного вещества высокойплотности, и на изображении выглядят как светлые объекты на темном фоне. Нарисунке 1.17 представлен пример негативного контрастирования уранилацетатомпри исследовании динамики структурных изменений миозиновых филаментовпод воздействием Ca2+ [68].
Интересно, что в данной работе исследователи36Рисунок 1.17. Негативное контрастирование уранилацетатом миозиновых филаментов[68].предложили новую методику отслеживания динамики биологических измененийвмиллисекундномвременноммасштабе,ограниченномлишьвременем37специфической фиксации уранилацетата с белковыми филаментами, тогда какстандартное минимальное время подготовки образцов определяется подготовкойсетки и временем высыхания контрастера (1-2 минуты).1.4. Применение АСМ для исследования полиморфизма амилоидовСтадии агрегацииВ понимании механизма сборки зрелых амилоидных фибрилл все ещеостается много пробелов.
Уровень структурной организации, начиная солигомеров, включает различные стадии. Предположительно, протофибриллырастут путем слияния олигомеров, конформационные изменения в которых(приводящие к увеличению β-структур) могут происходить как заблаговременно,так и одновременно с образованием протофибрилл [69–71]. С одной стороны,протофибриллы структурно схожи со зрелыми фибриллами (имеют линейнуюморфологию). С другой стороны, для амилоидного β-пептида имеются данныеЯМРосходствевнутримолекулярныхпротофибриллводородныхссвязейолигомерамиввобразованиипротивовеснасыщенныммежмолекулярным водородным связям в зрелых амилоидных фибриллах [72,73].Как известно, характерным признаком зрелых амилоидных фибрилл являетсякросс-β-структура, и для перехода олигомера в фибриллу, вероятно, происходитротация β-цепи на 90° в ходе созревания [73]. По-видимому, созревание фибриллпроисходитчерез перестройку структурыβ-листовпротофибриллы[74]посредством вовлечения новых аминокислотных остатков в β-тяжи [72].При исследовании транстиретина, транспортного белка, присутствующего вспинномозговойжидкостиорганизмачеловека,былиобнаруженыпротофибриллярные агрегаты, напоминающие “бусины на нити” (рисунок 1.18).АСМ-сканирование белка в водной среде с инкубацией в течение 10 недельвыявило рост червеобразных структур (проявивших типичные для амилоидовпризнаки – смещение спектра адсорбции Конго красного и связывание стиофлавином Т) и отсутствие зрелых фибрилл.
Вероятно, обнаруженные38Рисунок 1.18. АСМ-изображения транстиретина (белка, осуществляющего транспорттироксина и ретинола) и его агрегатов. На 5-й день инкубации (A) обнаружены небольшиепротофибриллы и олигомеры, на 6-й день (B) – более длинные протофибриллы. Спустя двенедели (C) проявилась тенденция червеобразных агрегатов ассоциировать их концами собразованием сети и узлов.
АСМ-сканирование после 10-и недель инкубации выявило плотнуюсеть протофибрилл с образованием пучков [75].протофибриллыимеютспецифическуюструктурнуюорганизациюипредставляют собой продукты альтернативного амилоидному пути агрегациибелка. Однако, известно, что стимулами для амилоидной агрегации in vivo и in39vitro могут быть различные клеточные компоненты (включая протеогликаныгликозаминогликаны, липиды или коллаген[76–78]), и, возможно, дляобразования зрелых фибрилл в экспериментах отсутствовал дополнительныйнеобходимый фактор.Полиморфизм амилоидных структурВ зависимости от типа белка и условий агрегации, промежуточныеинтермедиатыпомимофибриллярнойформыпредставленывширокомразнообразии: червеобразные “бусины на нити” [75], полукруглые, кольцевидные[79,80] и иные структуры (рисунок 1.19).
Это могут быть кольца из большогочисла олигомеров, либо похожие на поры структуры из нескольких олигомеров.Рисунок 1.19. АСМ-изображения слева направо: червеобразные “бусины на нити”транстиретина [75] и полукруглые и кольцевидные структуры лизоцима [80].Различныепротофибриллярныеагрегатымогутвозникатьитрансформироваться в ходе одного процесса.
В случае с N-терминальнымдоменом регуляторного белка транскрипции (фактора созревания гидрогеназы)E. coli HypF-N глобулярные олигомеры сначала ассоциируют в кольца, затемперестраиваются в ленты, созревающие в итоге в фибриллы (рисунок 1.20) [79].40Рисунок 1.20. Различные структуры на пути созревания фибрилл белка N-терминальногодомена фактора созревания гидрогеназы HypF [79].Образующиесяпромежуточнымразногозвеномвродацепиструктурысозреваниянеобязательноамилоидныхявляютсяфибрилл.Дляамилоидного β-пептида был показан альтернативный фибриллам путь агрегациибелка в подобные кольцевые структуры, найденные у пациентов с болезньюАльцгеймера[81–83].Можнопредположить,чтоформированиедаже41альтернативных структур в таких случаях связано с патофизиологическимиусловиями.Различные популяции протофибрилл могут сосуществовать вместе.
Приэтом, будучи морфологически схожими, они значительно отличаются в контурнойи персистентной длине, что отражается в разнице механических параметров,Квадрат расстояния между концамиR2*10-4 (нм2)таких, как жесткость или модуль Юнга (рисунок 1.21) [84].Контурная длина L (нм)Рисунок 1.21. Различные субпопуляции червеобразных структур N-терминальногодомена фактора созревания гидрогеназы HypF [84].Несмотря на общее сходство зрелых амилоидов (фибриллярная морфологияи кросс-β-структура), им присущ высокий полиморфизм на разных уровняхструктурной организации. Они могут вырасти из разного количества и типапротофибрилл, при этом наблюдать разнообразие можно при фиксированныхусловиях агрегации. Для амилоидного белка Aβ(1–40) было продемонстрированоодновременное сосуществование двенадцати различных фибриллярных структурс индивидуальной формой, толщиной и спиральностью (рисунок 1.22) [85].42Рисунок 1.22.
Крио-ЭМ 12 индивидуальных фибрилл амилоидного β(1-40) пептида. (a)Изображения ЭМ 12 индивидуальных фибрилл, обнаруженных на одном образце. (b,c) Видсбоку (b) и сверху (c) реконструкции фибрилл [85].Исследование бычьего сывороточного альбумина [49] выявило шестьодновременно сосуществующих типов амилоидных структур, как гибких, так ижестких, включая “нанотрубки”. При этом обнаружены различные путиформированияжесткихфибрилл:притрансформацииединственнойлевоспиральной протофибриллы получающаяся нанотрубка оказывается такжелевозакрученной, а в случае скручивания вместе двух левоспиральныхпротофибриллв результате наблюдается правая спираль фибриллы (рисунок1.23,1.24).Таким образом, смена хиральности в процессе созревания амилоидныхфибрилл сопровождается переходом на более высокий уровень структурнойсложности.43Рисунок 1.23.
АСМ-изображения полиморфных амилоидных фибрилл [49].Рисунок 1.24. Схематическая репрезентация путей созревания амилоидных фибриллбычьего сывороточного альбумина: (A) трансформация единственной левозакрученнойпротофибриллы в жесткую нанотрубку, (B) скручивание двух левоспиральных протофибрилл собразованием правоспиральной фибриллы [49].44Глава 2. Исследование палочкообразной агрегации σ70-субъединицыРНК-полимеразы E. coliУпоминание об образовании σ70-субъединицей РНК-полимеразы E.
coliагрегатов в одной из работ Lowe [9] подтолкнуло к идее использовать атомносиловую микроскопию для описания их морфологии и свойств (тем более, чтоэтот метод ранее не применялся для исследования данного белка и его агрегатов).Атомно-силовая микроскопия хорошо себя зарекомендовала в исследованиибиологических объектов и обладает большей чувствительностью в сравнении сбиохимическими методами для детекции единичных случаев взаимодействиямолекул (в том числе и агрегации). Поскольку σ70-субъединица РНК-полимеразыE. coli играет ключевую роль в инициации транскрипции, процесс еесамоорганизации может влиять на регуляцию транскрипции (например, путеминактивации σ70-субъединицы).
В частности, амилоиды могут служить в качестведепо и обеспечивать клетку необходимым количеством белка [45]. С другойстороны, агрегация может быть способом вывода свободной σ70-субъединицы изцитоплазмы с последующим распадом агрегатов в условиях превышенияконцентрации активного белка в той или иной стадии клеточного цикла.Подобный эффект инактивации был продемонстрирован длямутанта белкаrpoD8OO [9].2.1. Материалы и методыАтомно-силовая микроскопияНеобходимые для АСМ-экспериментов препараты белка σ70-субъединицыдикого типа и ее мутантов были предоставлены ведущим научным сотрудникомНИИ ФХБ им. Белозерского МГУ В.Л.
Друцей. Приготовление образцов σ70субъединицы для АСМ осуществлялось по следующей методике. Исходный белокконцентрацией 2,5-160 мкг/мл в деионизированной воде или в растовре(содержащем NaCl и/или MgSO4) наносился на свежесколотую поверхность45слюды. В случае использования раствора концентрация NaCl варьировала вдиапазоне 0-200 мМ, MgSO4 0-50 мМ, а значение pH раствора былоприблизительно равным 7,4. 10 минут происходила адсорбция, после чегоследовало высушивание образца. Затем образец промывался в течение 40 минутдля удаления неадсорбированных молекул и возможных примесей, после чегоснова следовало высушивание. При использовании высокоориентированногопиролитического графита (ВОПГ) в качестве подложки образец готовился поаналогичной схеме.Послеприготовленияобразцыисследовалисьсиспользованиеммультимодового атомно-силового микроскопа Nanoscope IIIa multimode (DigitalInstruments Inc., США) в полуконтактном режиме на воздухе. Были использованыкоммерческие кремниевые кантилеверы NSC11 с резонансной частотой 330 кГц.Частота сканирования обычно составляла 2 Гц, число пикселей 512x512.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
