Диссертация (1102290), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Например, присоединяя к белкуфлуоресцентную молекулу, можно создавать светособирающие материалы(рисунок 1.6) [44].Рисунок 1.6. Смесь доноров и акцепторов связывается с пептидами для сборки в волокно(слева). Доноры поглощают свет, который безызлучательным переносом попадает на акцептори испускается (светособирающая антенна) [44].Кроме этого, амилоидные фибриллы сами по себе применимы длярегуляции химической доступности биологически активных веществ.
Так, взадаче адресной доставки лекарств с использованием амилоидных фибрилл22пролонгированное действие достигается благодаря медленной диссоциациипептидов после введения. При лечении рака было показано, что эффектгонадолиберина значительно пролонгируется при введении фибриллярной формывещества вместо мономерной [45]. Амилоидные фибриллы также перспективны вкачестве матрикса для трехмерной сборки тканей [46], для репарации мозгапосредством регенерации аксонов [47] или для управления клеточной адгезией[48].Несмотря на обширный интерес к амилоидам, их структурные детали сталивыявляться с помощью биофизических методов совсем недавно. Благодарявысокоразрешающим технологиям стало ясно, что на молекулярном уровнеамилоиды представлены большим разнообразием структур.
Было показано, чтоидентичные полипептиды могут сворачиваться в отдельные амилоидныеконформации, и это структурное разнообразие может приводить к различнымприонным состояниям [24,49]. В лаборатории, in vitro, в зависимости отинкубационных условий (pH, температуры, ионной силы, концентрации белка,времени инкубации, наличия денатурирующих агентов и т.д.) можно получитькак бесформенные, так и разного рода гибкие, квазиупругие и палочкообразныеструктуры (рисунок 1.7) [49].абвРисунок 1.7.
АСМ-изображения гибких и квазиупругих структур β-лактоглобулина (а,б)и палочкообразной фибриллы бычьего сывороточного альбумина (в) [12,49].23Наиболее часто встречаемое в литературе описание амилоидов относится кфибриллярным образованиям, содержащим от двух до шести скрученных вместепротофиламентов.Вкаждоминдивидуальномпротофиламентебелокорганизуется в β-тяжи перпендикулярно длинной оси фибриллы (рисунок 1.8).Однако в последнее время все возрастающий интерес вызывают небольшиепрефибриллярные агрегаты, играющие ключевую роль в патогенезе по крайнеймере некоторых прионных заболеваний [18].Рисунок 1.8 Схема перехода глобулярных белков из частично разупорядоченногосостояния в зрелые амилоидные фибриллычерез промежуточные стадии – олигомеры ипротофиламенты [12].В исследованиях амилоидогенных белков и пептидов ученые частосталкиваются с присутствием структур червеобразной формы.
Некоторыерассматривают их как раннюю стадию образования зрелых амилоидных фибрилл[12,50], другие представляют в качестве альтернативного пути неамилоидной [51–53] или амилоидной [54,55] агрегации. Поскольку такие префибриллярные24агрегаты характеризуются высокой гетерогенностью, на сегодняшний деньостается много вопросов об их структуре, динамике образования и свойствах.В работах, посвященных исследованию σ70-субъединицы РНК-полимеразыE. coli, было установлено, что данный белок (или его мутант) может образовыватьагрегаты [9–11]. Так, Lowe с помощью электронной микроскопии впервыепоказал образование червеобразных структур дикого типа белка и его мутантаrpoD800 при нагревании (рисунок 1.9) [9].
Предположительно повышениетемпературыРисунок 1.9 Данные электронной микроскопии: A) дикий тип σ70-субъединицы(инкубация при 60 °С); B-C) мутант rpoD800 (инкубация при 46°С и 0 °С соответственно) [9].ведет к инактивации связывания белка с кор-ферментом и его агрегациипосредством образования частично денатурированных форм белка. Однакоприродаполучающихсясистематическомуагрегатовисследованиюнебылаагрегациивыявлена,иработпоσ70-субъединицыранеенепроводилось. Установление амилоидной природы и описание морфологии исвойств агрегатов σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coli и ее мутантов25помогут лучше понять, как можно регулировать процесс формированияамилоидныхфибрилл,посколькуфактическаясамоорганизацияфибриллконтролируется сложным взаимодействием физических и химических факторов.Механизм агрегации, движущая сила и молекулярные основы физических свойствамилоидных фибрилл являются актуальными задачами на сегодняшний день.1.3.
Методы исследованияпространственным разрешениемСегоднясуществуетцелыйамилоидныхрядструктурфизико-химическихсвысокимметодовдляисследования морфологических и структурных особенностей белковых агрегатов.Широко применяются для этих целей методы сканирующей зондовой (вчастности, атомно-силовой (АСМ)) и просвечивающей электронной микроскопии(ПЭМ).Атомно-силовая микроскопияПринцип работы атомно-силового микроскопа основан на регистрациисилового взаимодействия между поверхностью исследуемого образца и зондом. Вкачестве зонда используется наноразмерное остриё, располагающееся на концеупругой консоли, называемой кантилевером (рисунок 1.10).Рисунок 1.10.
Наноразмерное острие на конце упругой консоли (кантилевер) [56].26На зонд со стороны поверхности действуют различные силы, которыеприводят к изгибу консоли. Взаимодействие зонда АСМ с образцом приближенноописывается потенциалом Леннарда-Джонса: () = [( ) − ( ) ] (1. 1)(1. 1)где – расстояние между центрами взаимодействующих атомов зонда и образца; – глубина потенциальной ямы, – расстояние, при котором энергиявзаимодействия становится равной нулю.На больших расстояниях при приближении кантилевера к поверхности образца нанего начинает действовать сила притяжения, обусловленная диполь-дипольныминдуцированным взаимодействием.
Затем, на расстоянии в несколько ангстрем,молекулыотталкиваютсяиз-заобменноговзаимодействия.Появлениевозвышенностей или впадин под остриём приводит к изменению силы,действующей на зонд со стороны поверхности, а, значит, и изменению величиныизгибакантилевера.Типичнаясистемарегистрациивеличиныизгибапредставлена на рисунке 1.11.Рисунок 1.11. Типичная схема работы атомно-силового микроскопа [56].27Взависимостиотхарактеразондированияповерхностивыделяютразличные режимы АСМ-сканирования.
Традиционно используют контактный иполуконтактный режимы.В контактном режиме зонд приводится в механический контакт споверхностью образца. Система обратной связи измеряет и поддерживаетпостоянной величину изгиба кантилевера в ходе сканирования. Изображениеформируется посредством записи приложенного к пьезоэлектрическому приводунапряжения, необходимого для поддержания фиксированного отклоненияположения кантилевера. Однако такой режим вследствие сильного воздействия наобразец мало пригоден для исследования объектов с малой механическойжесткостью, к которым относятся биологические объекты.Бесконтактный и полуконтактный относят к динамическим режимамсканирования, поскольку в них с помощью пьезоэлектрического приводакантилевер приводится в колебания с частотой, близкой к резонансной частотекантилевера. Взаимодействие зонда с образцом меняет амплитудно-частотные ифазово-частотные характеристики колебаний.
Система обратной связи при этомобычно поддерживает постоянной амплитуду колебаний зонда, а изменениечастоты и фазы в каждой точке записывается. Однако возможно установлениеобратной связи путём поддержания постоянной величины частоты или фазыколебаний.Кантилеверы традиционно изготавливают из кремния или нитрида кремния.Последние состоят из тонкой пленки нитрида кремния, нанесенной химическимосаждением на кремниевую подложку.
Кантилеверы из нитрида кремния имеютмалую константу упругости, и поэтому используются, в основном, в контактномрежиме сканирования. Монолитные кантилеверы, сделанные из одного материала(кремния),лучшетем,чтонедеформируютсявследствиетепловогонесоответствия материалов слоев пленки и подложки, а также обладают высокимQ-фактором, важным для динамического режима АСМ. Финальное изготовлениезонда осуществляется в процессе анизотропного химического травления.Ключевым составляющим анизотропного травления является вытравливание28различных направлений кристалла в различной степени с использованиемтравителя (например, KOH).
Направление(100) травится гораздо быстреенаправления (111). Типичная схема процесса изготовления зонда представлена нарисунке 1.12.Рисунок 1.12. Последовательные стадии изготовления кантилевера [57].Стартовой точкой служит кремниевая подложка с ориентацией (100), накоторую наносят методами литографии структурированный слой диоксидакремния SiO2, определяющий положение зонда и форму консоли. Дальнейшеедобавление КОН приводит к вытравливанию свободных от диоксида кремнияучастков подложки, причем с определенной формой на краях SiO2, из-за разницыв скорости травления в направлении Si(100) и Si(111).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
