Адсорбция и токсичность гербицида ацетохлора в почвах различных типов (1098303), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Полученную суспензию встряхивали пять часов, затемцентрифугировали в течение 15 мин при 5000 об/мин и меняли раствор насвежий. Процедуру повторяли пять раз. Затем осадок промывали, добавляя вцентрифужную пробирку дистиллированную воду, встряхивали 3 часа и опятьцентрифугировали. Процедуру проводили до отрицательной реакции на хлорв супернатанте. Полученную суспензию лиофильно высушивали.Получение адсорбционных комплексов каолинит-гуминовые кислоты.К 1 г каолинита, насыщенного кальцием (Са-каолинит), прибавляли 20 млраствора, содержащего 500 мг/л ГК и KCl в концентрации 0.1 М, иустанавливали рН 5.5 с помощью 0.1 М HCl и 0.1 М KOH. Суспензиювстряхивали в течение 48 часов и затем центрифугировали в течение 15 минпри 5000 об/мин.Для удаления непрочно связанных ГК к осадку добавляли 20 мл 0.1 МKCl, встряхивали 3 часа и центрифугировали в течение 15 мин при 5000об/мин. Операцию повторяли до полного удаления непрочно связанных ГК скаолинита – обычно требовалась шести-семикратная обработна.
ОтсутствиеГК в супернатанте определяли фотометрически. Полученные адсорбционныекомплексыкаолинит-гуминовыекислоты(каолинит-ГК)лиофильновысушивали.Определение содержания необратимо адсорбированных ГК. Осодержании ГК в комплексах судили по содержанию в них органическогоуглерода. Для этой цели определяли органический углерод в препаратахкаолинит-ГК на элементном анализаторе модели СHN–O–Rapid-Geraet фирмыHeraeus (ФРГ) в Институте экологической химии GSF (ФРГ).40Удельнуюповерхностьадсорбционныхкомплексовопределялиметодом сорбции водяного пара по Кутелику (Kutelik, 1962) аналогичноопределению удельной поверхности в почвах и ИФ.2.5. Методика определения ацетохлора поляризационнымфлуоресцентным иммуноанализом (ПФИА)При постановке адсорбционных экспериментов для определенияацетохлора использовали метод ПФИА.ВосновеопределенияацетохлораметодомПФИАлежитспецифическая реакции преципитации (реакция антиген-антитело) и явлениеполяризации флуоресценции.
Реакция преципитации происходит междуантигеном (в качестве которого выступает ацетохлор) и специфичным емуантителом, в результате образуются прочносвязанные комплексы антигенантитело. Если в реакцию преципитации в качестве антигена вводитьацетохлор, меченный флуоресцирующей меткой (трейсер), то для егорегистрации можно применять метод поляризации флуоресценции. Для этогополученный комплекс антиген-антитело облучают плоскополяризованнымсветом и измеряют частично поляризованное свечение комплекса.
Степеньполяризации флуоресценции (mP) комплекса антиген-антитело постоянна припостоянной температуре и соотношении трейсер:антитело и рассчитывается спомощью выражения:mP = 1000 ×Iv − I hIv + Ih(2.2.)где Iv – вертикальная составляющая флуоресценции (параллельнаялучу возбуждения);Ih–горизонтальнаясоставляющая(перпендикулярнаялучувозбуждения).Если в реакционную смесь, содержащую известное количествотрейсера, ввести некоторое количество немеченого ацетохлора, а затемдобавить антитела, то на основе конкурентной реакции будут образовыватьсякомплексы антитела как с немеченым ацетохлором, так и с трейсером. Как41следствие, степень поляризации флуоресценции (mP) испытуемого растворабудет снижаться, причем ее уменьшение будет обратно пропорциональноколичеству немеченого ацетохлора.
Таким образом, по снижению степениполяризации флуоресценции можно определить концентрацию введенногонемеченого ацетохлора.Для определения ацетохлора в работе использовали трейсер AMDAEDFRf0.88,представляющийсобойацетохлор,меченныйглициламинофлуоресцеином, и сыворотку антител (Rabbit anti-acetochlor BSAlot6 13.07.99), специфичных к ацетохлору. Оба вещества были получены влаборатории иммуноанализа кафедры химической энзимологии химическогофакультета МГУ под руководством к.х.н.
Еремина С.А. Для измеренияполяризации флуоресценции использовали TDx-анализатор фирмы "Abott"(США).Подбор рабочей концентрации трейсера. Рабочую концентрациютрейсера подбирали экспериментальным путем так, чтобы интенсивностьфлуоресценции раствора трейсера в боратном буфере (рН=7.4) была в 10 разбольше, чем интенсивность флуоресценции чистого буфера.Выбор рабочей концентрации антител. Для установления рабочейконцентрации раствора антител в 10 кювет последовательно разливали по 500мкл боратного буфера, после чего в первую кювету добавляли 50 мклсыворотки антител и 450 мкл буфера, что обеспечило начальное разведениеантител 1/20.
500 мкл полученного раствора переносили во вторую кювету, извторой кюветы отбирали 500 мкл и вносили в третью, и т.д. вплоть додевятой, что позволяло получить разведение сыворотки антител 1/20, 1/40,1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, 1/2560, 1/5120; в последней кюветеприсутствовал чистый буфер. В каждую кювету добавляли раствор трейсера вбуфере с рабочей концентрацией. Затем проводили измерение поляризациифлуоресценции. По полученным данным строили кривую связывания какзависимость степени поляризации флуоресценции от фактора разведениясыворотки антител (логарифмическая шкала).
Для дальнейшего анализаиспользоваликонцентрациюантител,42соответствующую50%-номусвязыванию трейсера. Связывание трейсера определяли по уменьшениюполяризации флуоресценции (mP).Измерениеконцентрацииацетохлора.TDxанализаторможетодновременно измерять 10 образцов. Поэтому для определения ацетохлора впять кювет вносили по 50 мкл исследуемых растворов, содержащихацетохлор, 500 мкл раствора трейсера и 500 мкл раствора антител. Пятьоставшихся кювет использовали для построения градуировочного графика.Для этой цели в кюветы вносили по 50 мкл раствора ацетохлора вконцентрации 0, 0.1, 0.5, 0.75, 1.0 мг/л, туда же вносили по 500 мкл растворовтрейсера и антител. Во всех кюветах измеряли поляризацию флуоресценции,строиликалибровочныйграфиквкоординатахmP –концентрацияацетохлора, по которому находили искомую концентрацию гербицида впробах.
Пример калибровочного графика приведен на рис. 2.2.mP17016015014013012011010000.250.50.751.0Концентрация ацетохлора, мг/л1.25Рис. 2.2. Калибровочный график для определения концентрацииацетохлора.Если концентрация ацетохлора превышала 1 мг/л, то аликвоты истандарты разводили в 10-100 раз дистиллированной водой.Определениеацетохлорав почвенныхвытяжках.Применениеописанной выше процедуры для анализа почвенных вытяжек показаломешающее влияние растворенного органического вещества, извлекаемого изпочв, на результаты определения.
Так, было установлено, что поляризация43флуоресценции ацетохлора в водной вытяжке из почвы, вне зависимости от ееразведения,быланиже,чемврастворахацетохлорааналогичнойконцентрации в дистиллированной воде (рис. 2.3).mP180дистиллированная вода160водные вытяжки:140без разведения120разведение 10100разведение 1008060lgC-6-4-202Рис. 2.3. Зависимость поляризации флуоресценции от концентрацииацетохлора в отсутствие (дист. вода) и присутствии растворенногоорганического вещества (водные вытяжки из почв).Для устранения данного эффекта стандартные растворы ацетохлораготовили не на дистиллированной воде, а на почвенной вытяжке, полученнойв ходе холостого адсорбционного эксперимента (0.1 М KCl при рН 5.5) какописано в п.
2.6. Содержание ацетохлора в исследуемых пробах определялипо полученному калибровочному графику.2.6. Методика исследования адсорбционной способностипочв, илистых фракций и комплексов каолинит-ГК поотношению к ацетохлоруВ работе использовали препарат гербицида Харнесс (Монсанто,Европа С.А.), содержащий 90% ацетохлора.Определение времени установления равновесия в системе почваацетохлор.Дляустановлениявремени44наступленияравновесиявадсорбционной системе почва-ацетохлор были проведены кинетическиеэксперименты на трех дерново-подзолистых почвах (ПДЦ, ПДОК, ПДК). Дляэтого в центрифужные пробирки вносили по 5 г протертой и просеянной черезсито воздушно-сухой почвы, добавляли 25 мл водного раствора ацетохлора вконцентрации 45.5 ммоль/л, интенсивно встряхивали и помещали намеханический вибратор, осуществляющий встряхивание суспензии с полнымоборотом пробирки.
Время контакта гербицида с почвой составило 0, 1, 3, 6,24 и 48 часов. По истечении указанных промежутков времени, суспензиюцентрифугировали в течение 15 минут при 5000 об/мин и определяликонцентрацию гербицида в супернатанте методом ПФИА. Полученныерезультаты приведены на рис.
2.4.Равновесная конц. ацетохлора, мг/л50П ДК4540ПДЦ353025ПДОК20061218 24 30 36Время адсорбции, ч4248Рис. 2.4. Кинетика адсорбции ацетохлора на дерново-подзолистыхпочвах.Каквидноизходаполученныхзависимостей,концентрацияацетохлора в растворе переставала значимо изменяться уже через шесть часовконтакта ацетохлора с почвой. Для гарантированного достижения равновесияво всех исследуемых системах, при определении адсорбционной способностипочв, илистых фракций и комплексов каолинит-ГК использовали времяконтакта 24 часа.Методика определения адсорбционной способности почв, илистыхфракций и комплексов каолинит-ГК по отношению к ацетохлору.
В45центрифужные пробирки вносили навески исследуемых сорбентов. Вэкспериментах с почвами вносили по 5 г протертой и просеянной через ситовоздушно-сухой почвы; с илистыми фракциями – по 1 г препарата илистойфракции, с комплексами каолинит-ГК – 0.2 г препарата. К навескамприбавляли по 25 мл водного раствора ацетохлора в возрастающейконцентрации: 0.05; 0.5; 2.3; 4.5; 6.8; 22.8; и 45.5 ммоль/л. Постояннуюионную силу поддерживали с помощью фонового электролита (0.1 М KCl);рН доводили до 5.5 с помощью 0.1 М KOH и 0.1 М HCl. После внесенияраствораацетохлоравстряхивалиипробиркипомещалинагерметичносуткиназакрывали,интенсивномеханическийвибратор,осуществляющий встряхивание суспензии с полным оборотом пробирки.Одновременно проводили холостой адсорбционный эксперимент, которыйпроходил в тех же условиях, но раствор не содержал ацетохлора.Через 24 часа суспензию почвы центрифугировали в течение 15 минутпри 5000 об/мин.
В полученном супернатанте измеряли равновеснуюконцентрацию не адсорбировавшегося на почве ацетохлора методом ПФИА.ВытяжкихолостогокалибровочногоэкспериментаграфикаприиспользовалипроведениидляПФИА.построенияКоличествоадсорбированного ацетохлора рассчитывали по разнице между содержаниемвнесенного и оставшегося в супернатанте гербицида.2.7. Определение токсичности ацетохлора в почвахметодом биотестированияВ чашки Петри помещали по 50 г почвы и вносили водный растворацетохлора в дозе 0.2, 1.0, 2.0, 20.0 мкл/кг почвы, что соответствуетпромышленным дозам внесения 0.02, 0.1, 0.2, 2 л/га, соответственно. Почвытщательно перемешивали.
Объем раствора гербицида подбирали такимобразом, чтобы после его внесения влажность почвы составила 60% отполевой влагоемкости. Для этого в почвах предварительно определялиполевую влагоемкость по методике определения полевой влагоемкости внарушенных образцах (Вадюнина и Корчагина, 1986). Чашки Петри ставилина ребро и выравнивали почву так, чтобы нижняя половина чашки Петри46была занята почвой, а верхняя половина – свободна от нее.
По поверхностипочвы проводили бороздку, в которую укладывали 10 пророщенных семянпшеницы Triticum aestivum (сорт “Московская-35”) так, чтобы корни всехсемян были ориентированы вниз, а побеги – вверх.Затем чашки помещали в термостат на 72 часа при температуре 25?С.Чашки ставили на ребро так, чтобы бороздка находилась в горизонтальномположении.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
