Жорина Л.В., Змиевской Г.Н. Основы взаимодействия физических полей с биологическими объектами (2006) (1095846), страница 19
Текст из файла (страница 19)
д. 5. Время жизни (затухания) т флуоресценции — время, в течение которого интенсивность флуоресценции уменьшается до уровня 1/е начального значения; связь между интенсивностью флуоресценции 1ф и временем жизни т определяется выражением -~/т 1фл = 1флов где 1ф,о — максимальная интенсивность флуоресценции во время возбуждения. Время жизни флуоресценции зависит от типа растворителя (окружающих молекул), от связи с другими молекулами, олигомеризации, изменения конформации молекул и т. д. 103 Основываясь на принципах расчета молекулярных спектров по Борну — Оппенгеймеру, можно вычислить собственное излучательное время жизни возбужденного состояния, которое для флуоресценции составляет 3,5 10 ч ~11(ч)Ых' (3.4) где х,а,х — сРеднЯЯ частота полосы поглощениЯ; 1а(х) — частотнаЯ зависимость коэффициента экстинкции.
Величина то представ- 1 ляет собой время жизни возбужденного состояния в отсутствие других путей потери энергии возбуждения (см. рис. 3.5). Если полоса поглощения симметрична, то 13.4) можно упростить: 8 3,5 10 (3.5) крах Нтах Ах' где дз и я1 — факторы вырождения триплетного и синглетного состояний соответственно.
Такие запрещенные переходы (см. В2) 104 Здесь 14,„ах — коэффициент экстинкции в максимуме полосы поглощения; Ьч11з — ширина полосы на половине высоты. Таким образом, можно рассчитать излучательное время жизни возбужденного состояния из спектроскопических данных. Флуоресценция является относительно быстрым процессом, поскольку излучательный переход разрешен: обычно то = 10 6... 10 ~ с. Это время велик6 по сравнению с единичным актом первичного по- -15 глощения (10 с), но в то же время оно малб по сравнению со временем распада возбужденного состояния при биолюминесценции и фосфоресценции. Отметим также, что вычисляемое таким образом время флуоресценции больше, чем экспериментально определяемое, поскольку фактическое время то представляет собой величину, обратную сумме всех констант скоростей процессов распада возбужденного состояния.
Излучательное время жизни фосфоресценции з 3 5'10 дз 8 (3.6) х „, ~ р(х) Ых к1 имеют малые коэффициенты экстинкции, и поэтому время жизни, вычисленное из (3.6), оказывается большим (от 10 З с до нескольких минут и даже часов). Это эквивалентно утверждению, что состояние, которое трудно заселить путем непосредственного возбуждения, также трудно распадается в результате излучательного процесса. По этой причине триплетные состояния играют преобладающую роль в фотохимии биомолекул, поскольку при прочих равных условиях они живут гораздо дольше синглетных и имеют более высокую вероятность вступить в фотохимическую реакцию. Этот факт усугубляется еще и тем обстоятельством, что в триплетном состоянии внешние электроны не спарены.
6. Степень поляризации Р и степень анизотропии г флуоресценции — распределение электромагнитных колебаний относительно направления наблюдения. Степень поляризации флуоресценции Р— это доля поляризованного света в общей суммарной интенсивности флуоресценции (см. В2). За время жизни т возбужденного состояния молекула успевает повернуться, происходит деполяризация излучения по сравнению с поглощенным квантом.
Деполяризация тем больше, чем быстрее поворачивается молекула, т. е. чем меньше вязкость ее окружения. Поэтому поляризацию флуоресценции определяют, чтобы, например, изучить микровязкость структуры клетки. Согласно формуле Перрена — Яблонского, 1(Р— 1/3 = П/Ро — 1/3)(1+ КТт17т1), где Ро — максимальная степень поляризации; т — время жизни флуоресценции; И вЂ” объем моля флуоресцирующих молекул; т1— вязкость среды.
Поляризация флуоресценции несет информацию о молекулярной организации биообъектов и патологических изменениях в тканях, клетках и субклеточных структурах. Анизотропное световое возбуждение позволяет выделить из хаотической группы атомов или молекул определенную группу. Многие важные биологические объекты характеризуются собственной флуоресценцией или имеют флуоресцирующие компоненты-флуорофоры. Собственную флуоресценцию не следует путать с биолюминесценцией. Напомним, что биолюминесценция есть процесс преобразования энергии химических реакций, в которых участвуют биомолекулы, в энергию электромагнитного излучения. Поглощение при биолюминесценции отсутствует. Собст- 105 венная люминесценции есть процесс высвечивания бнотканями предварительно поглощенной энергии электромагнитного излучения в виде электромагнитного же излучения.
Например, около 90;4 флуоресценции белков обусловлено наличием в них ароматической аминокислоты триптофана, остальная часть приходится на тирозин, фенилаланин, цестеин и цистин. Квантовый выход УФ-флуоресценции живой клетки составляет 1...4 ',4. При этом длины волн Хд = 275...280 нм, Хфд = 300...350 нм и время жизни т = 1...7 нс зависят от типа белка и третичной структуры, Спектры поглощения и испускания триптофана, тирозина н феиилаланина изображены на рис.
3,7. ел д МОЛЪ'СМ 1~„, Вт м2 240 260 280 Х, нм 300 400 Х, нм а б Рис. 3.7. Спектры поглощения (а) и флуоресценцни (б) триптофана (1), тирозвнв (2) и фенилаланина (3) Спектр поглощения триптофана определяется его индольным кольцом. Этой аминокислоте присущи две полосы поглощения: первая с максимумом в области 218 нм, вторая (преобладающая)— в области 280 нм. Даже малое содержание триптофана в белке существенно влияет на характер его спектров„так как молярный коэффициент поглощения этой аминокислоты в 4 раза больше, чем тирозина, и почти в 30 раз больше, чем фенилаланина.
При возбуждении молекул раствора триптофана ультрафиолетом с Х < 300 нм возникает его флуорссценция, максимум которой приходится на ) = 350 нм. Квантовый выход флуоресценции триптофана в нейтральном водном растворе прн комнатной температуре достигает 0,2. Спектр поглощения тирозина обусловлен его фенольным кольцом. Максимумы в спектре поглощения приходятся на 222 н ф 106 275 нм. В нейтральном водном растворе при комнатной температуре максимум флуоресценции тирозина приходится на 303...304 нм, квантовый выход равен 0,21. Спектры поглощения и флуоресценции фенилаланина связаны с наличием бензольного кольца.
Максимум в спектре поглощения приходится на 257 нм, квантовый выход невелик — 0,038 — 0,045. Если белок содержит все три аминокислоты, то в суммарном спектре флуоресценции преобладает триптофановая люминесценцня. При отсутствии триптофана спектры флуоресценции белковой молекулы и тнрозина практически совпадают. Свечение фенилаланина проявляется только при отсутствии других ароматических аминокислот. Таким образом, анализ спектров флуоресценции белка дает возможность прецизионного распознавания его состава. В клетках человека содержится много белков, в состав которых входят перечисленные аминокислоты. Это актин, миознн, тропонин, ферменты типа дегидрогеназы, фосфатазы, оксидазы, некоторые гормоны (АКТГ, СТГ, тиреоглобулин и др), пищеварительные ферменты (пепсин, трипсин, химотрипсин), альбумины и глобулины плазмы крови и ряд других веществ.
Собственная ультрафиолетовая флуоресценция этих белков определяется главным образом триптофаном, причем их спектры излучения сдвинуты в сторону коротких волн на 10...25 нм относительно спектров люминесценции водного раствора триптофана. Спектры белков, содержащих тирозин и фенилаланин в отсутствие триптофана н люмннесцирующих практически так же, как и тирозин, свойственны РНКазе, гистонам, коллагену, тропомиозину, инсулину н ряду других веществ. Их максимум практически совпадает с максимумом флуоресценции водного раствора тирозина (Х = 304 нм). Квантовый выход здесь мал (не выше 0,1, чаще 0,04-0,05). Флуоресцируют также восстановленные пиридин-нуклеотиды НАД Н н НАДФ Н2 (Хфд = 440...480 нм) и окисленные флавопротеины (ФП) ().ф = 510...540 нм), которые участвуют во внутриклеточных процессах: гликолиз, цикл Кребса, дыхание.
Поэтому при флуоресцентном анализе могут быть выявлены любые сдвиги в клеточном метаболизме, отражающиеся на динамике свойств НАД Н н ФП. ' РНК вЂ” рибонуклеиновая кислота. НА% — никотвнамидвденивдидукдеотид, НАДФ вЂ” кккотинамидадениндинукдеоткд-фвсфат. 107 Собственной флуоресценцией в УФ-диапазоне обладают сократительный аппарат клетки, митохондрии и некоторые другие клеточные структуры, причем ее интенсивность зависит от физиологического состояния клеток и меняется при различных воздействиях на них. Порфирины флуоресцируют в красной области спектра (630... 670 нм). Спектры собственной ультрафиолетовой флуоресценции различных клеток имеют качественное сходство.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
