Применение комплекса физико-химических методов для изучения мочевых камней и мочи и установления связи между ними (1091749), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Результаты термогравиметрического анализа оксалатов.Результаты дифференциально-термического и рентгенографического (см.1.3.1) анализов определения содержания кристаллизационной воды в оксалатахсогласуются между собой (табл. 8).1.3.1.3. Ик-спектроскопия (качественный и количественный анализ)Этот метод позволяет изучить локальное строение минеральных фаз,входящих в состав камня [2, 6, 14, 19, 23, 33], а также идентифицировать аморфныесоставляющие мочевых камней, в то время как рентгенографический анализ недает такой возможности без дополнительно проведенной методической работы.Метод ИК-спектроскопии обладает высокой разрешающей способностью и ,специфичностью, поэтому он весьма удобен при определении качественногосостава мочевых камней [78 – 80] и широко используется совместно срентгенофазовым анализом [2, 6, 14, 19, 23, 33].
Так, в работах [20, 35] фазовыйсостав коллекций почечных камней вначале изучали методом рентгенофазовогоанализа, что позволило идентифицировать различные соединения (вевеллит,ведделлит, апатит, мочевую кислоту и др.). Затем эти же образцы былипроанализированыметодомИК-спектроскопии,чтодаловозможностьдополнительно идентифицировать в составе почечных камней аморфный фосфаткальция и более четко, по сравнению с методом рентгенофазового анализа,провести идентификацию карбонатапатита и витлокита (заметим, что средиизученных нами мочевых камней витлокит не встречался).ИК-спектральныйфазовыйанализпроведенспомощьюИК-Фурьеспектрофотометра EQ 5.5.( Δr = 7 %.)49Качественный анализ основан на определении характеристических пиковвалентных колебаний функциональных групп, в частности, в оксалатах: С=О (1700см-1), С – О (около 1100 см-1), Н2О (3200 – 3400 см-1) [23].
В ПРИЛОЖЕНИИ 10, 11представлены ИК-спектры некоторых однофазных и многофазных образцов.На рисунке 16 а, б представлены дифрактограммы смешанного уратнооксалатного камня, состоящего из мочевой кислоты (2%) и вевеллита (98%)(образец № 13).МочеваякислотаабВевеллитМочеваякислотаМочеваякислотавРис. 16. Дифрактограмма периферии образца № 13: 98% вевеллит + 2% мочевая кислота(3%) (а); Дифрактограмма центра образца № 13: мочевая кислота (б); ИК-спектр образца №13: область 1 – периферия (100% вевеллит); область 2 – центр (100% мочевая кислота) (в)ИсследованиеобразцасприменениемИК-спектроскопиипозволилоподтвердить, что в составе центральной части мочевого камня № 13 – мочеваякислота, а на периферии – вевеллит.
Однако установить присутствие второгокомпонента (мочевой кислоты на периферии) в образце № 13 методом ИКспектроскопии с использованием представленного спектрометра не удалось.На рис. 17 представлены дифрактограммы и ИК-спектры мочевого камня,состоящего из брушита (95 %) и ведделлита (5 %) на периферии и брушита (46 %)и ведделлита (54 %) в центре по данным РФА (образец № 14)..50БрушитБрушитВедделлитВедделлитабPO43-PO43СО32-ОН-СО32-ОН-вгРис. 17. Дифрактограмма периферии образца 14: 95% брушит + 5% ведделлит(а); дифрактограмма центра образца 14: 46% брушит + 54% ведделлит (б); ИК –спектр периферии образца 14 (в); ИК – спектр центральной части образца 14 (г).На основании полученных ИК-спектров можно сделать вывод, что в составмочевого камня входят фосфатные и карбоксильные группы, кроме того в составкамня входит вода.
В связи с тем, что на ИК-спектрах отсутствуют пики,характерные аммонийной группе, можно сделать общий вывод, что камень состоитиз брушита и ведделлита. Кроме того, из рис. 17 в, г видно, что ИК-спектры центраи периферии абсолютно идентичны, тогда как на дифрактограммах внешней ивнутренней частей этого камня видны количественные отличия (рис. 17 а, б). Судяпо данным ИК-спектрокскопии, камень состоит из брушита и ведделлита, чтоподтверждает результаты рентгенофазового анализа (рис. 17 а, б).На рис. 18 представлена дифрактограмма аморфного мочевого камня (образец№ 15), и определение состава данного конкремента по данным РФА непредставляется возможным.
Однако аморфный пик на дифратограмме при 2θ =12.00° можно отнести к самому сильному отражению брушита (I=100%)(ПРИЛОЖЕНИЕ 7).PO43-абРис. 18. Дифрактограмма образца № 15 (а); ИК-спектр образца № 15 (б).51По данным ИК-спектроскопии установлено наличие фосфатной группы иотсутствие карбонатной, аммонийной и гидроксильной, из чего можно сделатьвывод, что он состоит из брушита, что согласуется с предположением на основанииРФА.
Следует отметить, что с применением данного метода нельзя разделитьсмесь гидроксилапатита, карбонатапатита и карбонатгидроксилапатита: авторы[72] выделяют только гидроксилапатит.Количественный анализ.В литературе описан метод количественного определения фазового составаодно-, двух- и трехфазных мочевых камней [23]. Содержание первого компонента,входящего в состав двухфазного мочевого камня, определяется по формуле:x100( H 2 a zH 2 b), (6)( H 2 a zH 2 b) ( zH1b H 1 a)где H1a – значение высоты пика первого эталона-стандарта при длине волныA;H2a – значение высоты пика второго эталона-стандарта при длине волны A;H1b – значение высоты пика первого эталона-стандарта при длине волны B;H2b – значение высоты пика второго эталона-стандарта при длине волны B;x - процентное содержание первого минерального компонента в камнесмешанного состава.z – соотношение пиков на спектре конкремента (определяетсяэкспериментально):z( H 1a / 100) X (( H 2 a / 100)(100 X ))( H 1b / 100) X (( H 2 b / 100)(100 X )) (7)На спектрограмме мочевого камня (рис.
19 б) – образец № 16 (по даннымРФА этот образец состоит из 83 % вевеллита и 17 % ведделлита, рис. 19 а) –определяются пики с длиной волны, характерной для оксалатов (ПРИЛОЖЕНИЕ12), свидетельствующие о присутствии в образце вевеллита (3053 см-1, первыйкомпонент) и ведделлита (3450 см-1, второй компонент).Затем, пользуясь данными [23], выбираем любые две длины волныхарактерных пиков поглощения (в данном случае, 3450 и 3053 см-1) и измеряемвысоту пика первого компонента при длине волны А (3450 см-1) и длине волны В(3053 см-1).
По формуле (6) находим процентное содержание первого компонента:52вевеллит (х = 80 %), количество второго компонента - ведделлита х=20 %, чтосовпадает с результатами РФА (83 % вевеллита и 17 % ведделлита) в пределахдопустимой погрешности.3450 см-13053 см-1абРис. 19. Дифрактограмма образца 16 (а); ИК-спектр образца № 18(б).Необходимо отметить, что количественная ИК-спектроскопия довольносложна в исполнении и требует наличия эталонных ИК-спектров компонентов иотработки соответствующей методики определения полос, характерных длякаждой из фаз и их интенсивности.
В настоящее время в России ИК-спектроскопиядля количественного анализа не нашла широкого применения. Однако в США длясерии ИК-Фурье спектрометров Nicolet создана библиотека ИК-спектров (для 25различных фаз, входящих в состав мочевых камней), позволяющая проводитьколичественный фазовый анализ двух- и трехкомпонентных мочевых камней [72].1.3.1.4.Спектрофотометрия (определение содержания белка)Для определения белка во всех видах мочевых камней нами использовалсяметод Лоури.
Необходимо отметить, что авторами работы [13], которые применялиметод Лоури для тех же целей, щелочной гидролиз проводили в течение 8 часовпри комнатной температуре, что явно недостаточно для полного извлечения белкаиз мочевых камней. В работе [2] содержание белковых компонентов и компонентовс пептидной связью определено по методу Бенедикта. При этом для их извлеченияиспользовалась смесь хлороформа и этилового спирта в соотношении 1:1. Данныйметод позволяет определять компоненты с пептидной связью в диапазонеконцентраций от 0.1 до 2 мг в пробе, тогда как метод Лоури является болеечувствительным и работает в диапазоне от 10 до 100 мкг в пробе.Содержание белка в мочевых камнях разных композиций определено методомЛоури на спектрофотометре СФ-26 (длина волны λ=750 нм). При построенииградуировочного графика использовались 6 стандартных растворов триптофана53C11H12N2O2 с концентрацией от 8 до 48 мкг/мл.
Для установления временищелочного гидролиза проводилось исследование выделившегося белка (на примередвух образцов) из навески измельченного камня (образец № 17 – 0.1 г; образец №18 – 0.15 г) в растворе 0.1М NaOH в дискретном временном интервале 24 -144часов (табл. 9) при комнатной температуре.
Экспериментально установлено, что втечение 24, 48 и 72 часов белок выделялся не полностью, а в течение 120 и 144часов выделившийся белок разлагался. Таким образом, найдено, что наибольшаяконцентрация белка выделяется при гидролизе в течение 96 часов (табл. 9) ( Δr = 7%).Таблица 9. Влияние времени щелочного гидролиза на концентрацию белка врастворе (на примере двух образцов).Время выщелачивания, час24487296120144Концентрация белка, мкг/мл (в растворе)Образец № 17Образец № 18194422502460266225612460По нашим данным, наибольшее количество белка содержится в оксалатныхмочевых камнях (рис.
20), а наименьшее – в фосфатных, что согласуется слитературными данными [2].Масс. %Рис. 20. Среднее содержание белка (масс. %) в составе мочевых камней.54Однако общее количество органической составляющей в фосфатах больше (вчастности, в апатитах), о чем свидетельствует вид дифрактограмм (5): большойфон на дифрактограммах, расширенные дифракционные отражения и аморфное«галло» в ближних углах.1.3.1.5. Газовая хроматография с пламенно-ионизационным детектором(определенеие органических небелковых компонентов)В состав небелковых органических компонентов мочевых камней могутвходить продукты нормальных процессов жизнедеятельности (метаболизма) ворганизме человека.
Это в основном предельные углеводороды, их спирты, кетоныи кислоты. Данные вещества попадают в камень из мочи и являются показателемконкретного заболевания (например, согласно [62], наличие кетонов в составесуточной мочи в количестве более 50 мг может свидетельствовать о сахарномдиабете или онкологических заболеваниях). Небелковые органические компонентыв моче выявляются методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационнымдетектированием (ГХ-ПИД) [63], но их наличие в составе мочевых камней кнастоящему времени не определялось.
Мы применили данный метод дляопределения небелковых органических компонентов в составе мочевых камней.Для анализа использовался Хроматограф Кристалл-2000М с пламенноионизационным детектором и капиллярной колонкой ZB-5, длиной 30м.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
