Автореферат (1091662), страница 3
Текст из файла (страница 3)
С увеличением концентрации сополимера и содержания в нём звеньев 2-метил-5винилпиридина зависимость Tп от рН смещаются в область более низких температур. Так, Tп для2%-ного раствора рН 7,5 сополимера с содержанием 2М5ВП 25 моль% составляет 63 ˚С, тогда как0,02%-ный раствор сополимера с 2М5ВП 55 моль% начинает мутнеть при 1 ˚С.12 Tп , ⁰C7025 моль%Tп , °C35 моль%Концентрациясополимера900,1%500,02%0,01%Концентрация7030сополимера2%1%0.5%5066,5Tп , °C77,51085pH6Tп , °C40 моль%7Концентрациясополимера0,005%0,1%0,05%40400,01%0,02%0,01%20200056789рН9рН55 моль%Концентрация 60сополимера60856789рНРисунок 8(а) – Зависимость температуры помутнения водных растворов сополимеров от рН.13 pH40 моль%850 °CpH55 моль%40 °C40 °C30 °C30 °C20 °C20 °C7810 °C76650,000,0450,080,12 0,00[сополимер], мас.%0,010,020,03[сополимер], мас.%Рисунок 8(б) – Зависимость температуры помутнения от концентрации сополимера приразличных рН на примере водных растворов сополимеров содержащих 40 и 55 моль% 2М5ВП.В соответствии с существующими требованиями рН лекарственных форм ветеринарныхвакцин должен составлять 6,5 – 7,4.
Поэтому была исследована возможность расширениядиапазона концентраций сополимеров с высоким содержанием 2М5ВП, в интервале которых онимогут быть использованы в качестве адъювантов.Известно, что на растворимость сополимеров в воде влияют соли неорганических кислот,добавление которых в невысоких концентрациях может, как увеличивать, так и уменьшатьрастворимость сополимера в воде.Добавление неорганических солей, обычно используемых при создании лекарственныхформ, к 0,1%-ному раствору сополимера, содержащему 35 моль% 2М5ВП, показало, что Тпзависит не только от концентрации соли, но и её природы (Рисунок 9).
Так, введение карбонатов исульфатов калия в концентрации до 0,5 ммоль/л значительно снижает растворимость сополимеровв воде. Введение же иодидов и хлоридов калия в небольших концентрациях (до 3 и 1,5 моль/л,соответственно) несколько улучшает растворимость сополимера, однако, дальнейшее увеличениеконцентрации соли приводит к снижению Тп.Добавление к 0,1%-ному раствору сополимера, содержащего 35 моль% звеньев 2-метил-5винилпиридина, небольшого количества додецилсульфата натрия приводит к существенномуулучшению его растворимости в воде (Рисунок 10).
Так, при увеличении концентрации ПАВ с 0до 0,5 ммоль/л Тп. повышается с 23 до 45 0С.14 T п ⁰C282318IClCO313SO4C(соли) моль/л800,511,522,53Рисунок 9 – Зависимость температуры помутнения 0,1% раствора сополимера ссодержанием 2-метил-5-винилпиридина 35 моль% при рН=7 от концентрации солей.T п ⁰C7060504030С ддс ммоль/л2000,20,40,60,811,21,41,61,82Рисунок 10 – Зависимость температуры помутнения 0,1% раствора сополимера ссодержанием звеньев 2-метил-5-винилпиридина равным 35 моль% при рН=7 от концентрацииДДС.15 В результате проведённых исследований были определены оптимальные параметры дляизготовления ЛФ на основе сополимеров N-ВПД и 2М5ВП соответствующих требованиямВГНКИ:1) Наиболее целесообразно использовать сополимеры с содержанием 2М5ВП 25-35моль%, так как их растворы мутнеют при более высоких температурах и концентрациях, чемсополимеры с большим содержанием 2М5ВП.2) Вкачествевеществ,увеличивающихрастворимостьсополимеров,можноиспользовать хлориды и йодиды, а также додецилсульфат натрия в допустимых для вакцинконцентрациях.3) В процессе приготовления ЛФ необходимо использовать концентраты растворовсополимера, подкисленные до рН 6,5, или охлаждённые ниже 20 ˚С для 0,1%-ного растворасополимера, содержащего 35 моль% 2М5ВП, и ниже 57 ˚С для 2%-ного раствора сополимера,содержащего 25 моль% 2М5ВП.3.
Исследование иммуноадъювантных свойств сополимеров N-винилпирролидона и2-метил-5-винилпиридина в составе вакцин на лабораторных и сельскохозяйственныхживотныхВ ходе проведённых исследований была изучена возможность повышения эффективностивакцин путём комбинированного ведения ее с сополимером N-ВПД и 2М5ВП. Оценкаиммуноадъювантной активности проводилась на морских свинках в композиции с живойвакциной против сибирской язвы животных, кроликах в композиции с ассоциированной вакцинойпротив миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов и цыплятах в вакцинах спротивогеном вируса гриппа А птиц подтип H5N1. Также были определены оптимальные дозыадъюванта и вакцин для формирования надежного иммунитета у животных.В более ранних исследованиях на различных биообъектах было доказано, что исследуемыесополимеры, вне зависимости от их мономерного состава, обладают низкой токсичностью, неоказывают тератогенного и канцерогенного воздействия [Кедик С.А.
и соавторы, 1993]. При этомих биологическая активность возрастает с увеличением содержания 2М5ВП. Так как водныерастворы сополимеров, содержащие более 35 моль% 2М5ВП, нестабильны в разрешённом длявакцин интервале температур, концентраций и рН, для исследования иммуностимулирующегодействиябылвыбрансополимерN-винилпирролидонаи2-метил-5-винилпиридина,характеристики которого приведены в таблице 4.16 Таблица 4. Характеристики сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина,синтезированного для исследований биологической активности.ПараметрОписаниеПотеря в массе при высушиванииХарактеристическая вязкостьПерекисные соединенияСодержание звеньев 2-метил-5-винилпиридинаКоличественное определениеЦиклогексанСополимер №3Белый порошок1,70 %0,1045 дл/г0,058 %34,86 моль%98,0%0,0003 %N-винилпирролидон0,090 %Альфа-пирролидон0,09 %3.1.
Определение специфической активности по показателю индекса иммунитета наморских свинкахДля поиска оптимальной схемы введения сополимера и вакцины морских свинок массой300 ± 50 г разбили на три группы по 10 особей:1) сополимер вводили за 14 дней до вакцинации в объёме 0,5 мл в дозе 1 мг/кг;2) сополимер вводили одновременно с вакцинацией в объёме 0,5 мл в дозе 1 мг/кг;3) вакцинация без использования сополимера;4) негативный контроль.Через 14 суток после вакцинации выживших морских свинок и 8 контрольных здоровыхморских свинок заражали стандартной референс-заражающей сибиреязвенной культурой, вводяподкожно в области живота по 0,5 мл в дозе 200 ЛД50.ЛД50 референс-заражающей культуры штамма М-71 возбудителя сибирской язвыпроводилось на 20 здоровых морских свинках массой 300 ± 50 г.
Группам из 5 животных вводилиоднократно п/к в области живота по 0,5±0,05 мл суспензии спор, содержащей 125 тыс., 25 тыс., 5тыс., 1 тыс. и 200 спор штамма М-71.Наблюдение за животными осуществляли в течение 10 суток после заражения. Образцыпечени, селезенки, легких, лимфатических узлов погибших животных высевали на плотнуюпитательную среду для подтверждения гибели в результате заражения культурой Bacillusanthracis. Результаты определения ЛД50 референс-заражающей культуры штамма М-71представлены в Таблице 5.17 Таблица 5.
Определение ЛД50 референс-заражающей культуры штамма М-71.Дозазаражения,тыс.спор12525510,2Кол.голов155555-2Дни наблюдения (пало)345678910Пало/всего-322-1-15/54/54/54/52/512231-1---∑Li3,8Величина ЛД50 рассчитывалась по формуле Кербера и составила 617 спор.lgLD50 = lgDN – δ(SLi – 0,5),где: DN - максимальная из испытанных доз, δ – логарифм кратности испытанныхразведений, Li – отношение числа животных, павших от введения данной дозы, к общему числуживотных, которым эта доза была введена.Наблюдение за вакцинированными животными после заражения осуществляли в течение 10суток.
Образцы печени, селезенки, легких, лимфатических узлов всех погибших животныхвысевали на плотную питательную среду для подтверждения гибели животного от инфекции.Индекс иммунитета (ИИ) определяли как отношение величины иммунизирующих доз(ИмД50), полученной для группы иммунизированных животных, к величине ИмД50, полученнойдля группы опытных животных:lg ИмД50 = lg Dn – d (å Li - 0,5),где: Dn – максимальная из испытанных доз (для 5 млн. спор lg Dn =6,699); d - логарифмкратности испытанных разведений (для шага разведения препарата, равного 5, d=0,699); Li –отношение числа выживших животных к общему числу морских свинок, которым были введеныдозы испытуемого препарата.Результаты определения специфической активности по показателю индекса иммунитета наморских свинках представлены в Таблице 6. Введение сополимера как одновременно, так и за 14дней до вакцинации повышало эффективность вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ B.
anthracis в2,0 – 2,9 раза, что повысило выживаемость животных до 75 – 87 % против выживаемости 50 – 57% без использования иммуноадъюванта в тех же дозах вакцинации. Помимо этого былоустановлено, что введение сополимера в композиции с вакциной (группа 2) существенноувеличивает безопасность ветеринарной вакцины для животных. Так, в группе 2 погибла толькоодна морская свинка, тогда как в группе 3 смертность достигала 30 % для дозировки 2 млнспор/мл (Рисунок 11).18 Таблица 6. Определение индекса иммунитета на морских свинках.Группыживотных123Дозавакцины,спор/млКол – воживотныхПало послевакцинации10 млн10187/82 млн10186/8400 тыс10283/880 тыс9183/810 млн9-86/82 млн9-86/8400 тыс9184/880 тыс8-82/810 млн9174/72 млн9363/6400 тыс9183/880 тыс8-80/8-5-50/5Негативныйконтроль90Выживаемость, %80Количество Выжило/зараженныхвсегоживотных∑LiИмД50,тыс.спорИИ2,42302,912,23352,01,76701,0---1 - Сoпoлимeр ввoдили зa 14 днeйдo вaкцинaции702 - Сoпoлимeр ввoдилиoднoврeмeннo с вaкцинaциeй603 – Сополимер не вводили50403020100800004000002000000Доза вакцины, спор/мл10000000Рисунок 11 – Выживаемость морских свинок, зараженных B.
anthracis, после иммунизациивакциной с сополимером N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина или без него.Таким образом было установлено что оптимальной схемой вакцинации в данной моделиявляется совместное введение вакцины и адъюванта в дозе 2 млн спор/мл и 1 мг/кгсоответственно.19 3.2 Определение иммуноадъювантных свойств сополимера N-винилпирролидона и 2метил-5-винилпиридина при вирусной геморрагической болезни кроликовВ исследовании использовали кроликов породы Шиншилла массой 3,0 ± 0,5 кг, которыхразбили на 7 групп по 4 животных в каждой. Дизайн и результаты исследования краткопредставлены в Таблице 7.Использование комбинации сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридинас инактивированной вакциной против вирулентного вируса геморрагической болезни кроликов(ГБК) штамм «В-87» (инфекционная активность не менее 103 ЛД50/мл) позволяет существенноактивировать иммунитет в сравнении с консервативным использованием вакцин (Таблица 7).Таблица 7.
Уровень титра антител в РЗГА после иммунизации и результаты защитыкроликов от контрольного заражения.Номер группы№животного1. Однократное введениевакцины в разведении1:5012341234123412341234123412342. Однократное введениевакцины в разведении1:1003. Однократное введениевакцины в разведении1:50 с сополимером в дозе50 мкг/кг4. Однократное введениевакцины в разведении1:50 с сополимером в дозе150 мкг/кг5. Однократное введениевакцины в разведении1:100 с сополимером вдозе 50 мкг/кг6.
Однократное введениевакцины в разведении1:100 с сополимером вдозе 150 мкг/кг7. Контрольная группаТитр АТ в РЗГА7 сут 14 сут 21 сут1:41:41:81:401:41:401:81:41:401:41:41:81:161:41:8001:4001:401:41:81:801:41:41:81:41:41:41:41:401:81:41:81:81:161:1601:41:41:401:41:401:401:41:8001:41:81:400001:41:161:41:161:161:161:16001:41:801:401:40001:8РезультатконтрольногозараженияПалПалПалЖивПалПалПалПалПалПалЖивПалЖивЖивЖивЖивПалПалПалЖивПалПалПалПалПалПалПалживПало/всего3/44/43/40/43/44/43/420 В1и2группеживотных,вакцинированныхбезсополимера,уровеньвируснейтрализующих антител составлял 1:4 в реакции задержки гемагглютинации на 14 сутки ипрактически отсутствовал спустя три недели, что совпадало со значениями контрольной группы.Использование комбинации вакцины в разведении 1:50 с иммуностимулирующим препаратомповысило уровень антител до 1:16 даже на 21 сутки. При этом проверка активности иммунитетапутём контрольного заражения кроликов вирулентным вирусом в дозе 1000 ЛД 50 на 21 суткипосле вакцинации с сополимером в дозе 150 мкг/кг показала 100 % выживаемость животныхопытной 4 группы, по сравнению с 80 – 100 % гибелью в остальных.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
