Физико-химические процессы, протекающие при брожении

Физико-химические процессы, протекающие при брожении

Анаэробное брожение — это процесс, посредством которого микроорганизмы получают химическую энергию из глюкозы и других субстратов в отсутствии или при дефиците молекулярного кислорода. Его следует рассматривать как простейшую форму биологического механизма, обеспечивающего получение энер­гии из питательных веществ.

Дрожжевые клетки и молочнокислые бактерии - факультатив­ные анаэробы. Главным клеточным «топливом» при анаэробном получении энергии служат шестиуглеродные сахара, в первую оче­редь D-глюкоза; при спиртовом брожении, вызываемом дрожжами, пентозы не сбраживаются. Некоторые бактерии способны извле­кать энергию, сбраживая пентозы, жирные кислоты или аминокис­лоты. Среди многих способов сбраживания глюкозы наиболее важ­ную роль играют два тесно связанных между собой — гомоферментативное молочнокислое брожение и спиртовое брожение.

При гомоферментативном молочнокислом брожении моле­кула гексозы расщепляется на две трехуглеродные молекулы мо­лочной кислоты (лактата), представляющей собой единственный конечный продукт этого процесса.

 ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ, ПРОТЕКАЮЩИЕ ПРИ ГЛИКОЛИЗЕ

И СПИРТОВОМ БРОЖЕНИИ

При спиртовом брожении шестиуглеродная молекула глюкозы расщепляется на две двууглеродные молекулы этанола (С₂Н₅ОН) и две молекулы диоксида углерода (С0₂). Спиртовое брожение осу­ществляется тем же ферментативным путем, что и гликолиз, с той разницей, что последняя, завершающая реакция заменена здесь двумя другими, в результате которых трехуглеродные фрагменты разрушаются до этанола и диоксида углерода.

Оба эти процесса включают окислительно-восстановитель­ные реакции. Об этом отчетливо свидетельствуют конечные про­дукты спиртового брожения; этанол можно рассматривать как относительно восстановленное соединение, т.к. его молекула со­держит определенное количество водорода, а диоксид углерода — как относительно окисленное, поскольку водород в его молекуле отсутствует. В конечных продуктах гликолиза окислительно-вос­становительный процесс не столь очевиден. Однако один конец молекулы молочной кислоты (метильная группа) находится в бо­лее восстановленном состоянии, чем другой ее конец (карбок­сильная группа). В молекуле глюкозы атомы водорода распреде­лены более равномерно.

Рекомендуемые материалы

Суммарные уравнения гликолиза и спиртового брожения имеют вид:

Процесс гликолиза сопровождается сильным уменьшением свободной энергии, составляющим 135,65 кДж. Это необрати­мый процесс, смещенный в сторону образования лактата.

Гликолиз объединяет три типа химических превращений, пути которых взаимосвязаны: 1) реакции, вызывающие распад глюкозы с образованием конечного продукта - лактата

2) реакции, в результате которых неорганический фосфат (Ф_н) становится концевой группой АТФ и

 3) окислительно-вос­становительные реакции - путь переноса электронов.

В гликолиз вовлекаются и другие углеводы — крахмал и гли­коген, простые сахара (не D-глюкоза) при участии некоторых до­полнительных ферментов. Фермент а-1,4-глюканфосфорилаза катализирует общую реакцию, в которой (глюкоза)_n означает полисахаридную цепь глюкана, а (глюкоза) — туже цепь, но уко­роченную на одну единицу:

  (Глюкоза)_n +НР0₄ ^-2    ↔  (Глюкоза)_п_₁ + Глюкоза – 1 - фосфат.

Фермент атакует нередуцирующий конец цепи до тех пор, пока не достигнет точки ветвления, т.е. до α-1,6-связи. Конечным про­дуктом его действия оказывается остаточный декстрин. Для возоб­новления действия а-1,4-глюканфосфорилазы должен предвари­тельно вступить в действие фермент α - 1,6-глюкозидаза, гидролизу-ющий α -1,6-связь в точке ветвления и открывает для действия α -1,4-глюканфосфорилазы новый участок полисахаридной цепи.

D-манноза и D-фруктоза могут фосфорилироваться в положе­нии 6под действием гексокиназы. D-галактоза включается в глико­лиз в результате фосфорилирования, катализируемого галактокиназой в присутствии АТФ. В гликолиз могут вовлекаться и пентозы.

Для организмов, подобных дрожжам, сбраживающим глюко­зу до спирта и С0₂, а не до молочной кислоты, процесс брожения совпадает с гликолизом во всем, за исключением концевого эта­па, катализируемого лактатдегидрогеназой. При спиртовом бро­жении этот процесс заменен двумя другими ферментативными реакциями, катализируемыми соответственно пируватдекарбосилазой и алкоголъдегидрогеназой.

Пируватдекарбоксилаза требует наличия ионов Mg²⁺ и ко-фермента тиаминпирофосфата (ТПФ) - эфира пирофосфорной кислоты и тиамина (витамина В₁). Тиаминпирофосфат служит переносчиком активных альдегидных групп

В заключительной стадии процесс спиртового брожения аце-тальдегид восстанавливается до этанола под действием фермента алкогольдегидрогеназы; при этом роль восстановителя играет HADH + Н⁺:

В это уравнение не входят HADH и HAD⁺, так как HADH, образованный в процессе гликолиза, опять превращается в HAD⁺ в результате восстановления уксусного альдегида в этанол. Такая регенерация HAD⁺ обеспечивает в анаэробных условиях непре­рывное течение гликолиза.

Реакции, обеспечивающие выделение энергии, сохраняемой в форме АТФ, при гликолизе и при спиртовом брожении идентичны.

Спиртовое брожение является важнейшей стадией в техноло­гии хлеба. Его цель - разрыхление теста диоксидом углерода, при­дание тесту физических свойств, обеспечивающих его разделку, расстойку и выпечку. Образующиеся при брожении теста под дей­ствием дрожжевых клеток наряду с диоксидом углерода и этано­лом побочные продукты, обусловливают вкус и аромат хлеба.

Брожение ведется при температуре 27 — 35 °С, величина рН изменяется при брожении от 6,0 - 5,8 до 5,0 и ниже, что связано с растворением в полуфабрикате диоксида углерода и накоплени­ем органических кислот.

Молочнокислое брожение в технологии ржаного хлеба явля­ется основной стадией производства. В процессе жизнедеятельно­сти гомо- и гетероферментативных молочнокислых бактерий на­капливается достаточные количества молочной кислоты, необхо­димой для ингибирования а-амилазы, активность которой в ржа­ной муке весьма высокая. Чрезмерная деятельность этого фермен­та приводит к интенсивной декстринизации крахмала, особенно на стадии выпечки, когда β-амилаза уже инактивирована.

Именно молочной кислоте принадлежит основная роль в при­дании ржаному хлебу специфического вкуса и приятного аромата. Кроме того, образующийся в результате жизнедеятельности гете­роферментативных молочнокислых бактерий диоксид углерода участвует в разрыхлении заквасок и теста.

В зависимости от соотношения гомо- и гетероферментативных бактерий и от условий их жизнедеятельности в закваске и тесте про­дукты брожения будут накапливаться в разных количествах. Более высокая активность гетероферментативных бактерий обеспечивает разрыхленность ржаного теста. Однако в тесте при действии этих бактерий накапливается также значительное количество уксусной кислоты. В результате хлеб приобретает неприятный кислый вкус. Превалирующее гомоферментативное брожение способствует на­коплению в тесте в достаточном количестве молочной кислоты, придающей хлебу мягкий, приятный кисловатый вкус.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ, ПРОТЕКАЮЩИЕ ПРИ ДРУГИХ ТИПАХ БРОЖЕНИЯ

Помимо указанных выше типов брожения существуют и дру­гие типы, многие из которых представляют собой варианты пути Эмбдена — Мейергоффа.

При гетероферментативном молочнокислом брожении из каж­дой молекулы глюкозы образуется по одной молекуле молочной кислоты, этанола и диоксида углерода. Кроме молочной кислоты, гетероферментативные молочнокислые бактерии образуют уксус­ную кислоту. Катаболизм глюкозы при этом типе брожения осуще­ствляется до глицеральдегид-3-фосфата по фосфоглюконатному пути. Образовавшийся ангидрид уксусной и фосфорной кислот превращается в уксусную кислоту или восстанавливается в этанол:

При других типах брожения углеводов образуются такие ко­нечные продукты, как пропионовая, масляная, янтарная кисло­ты и ацетон.

Бактерии рода Clostridium являются возбудителями масляно-кислого брожения, суммарное уравнение которого приведено ниже:

С₆Н₁₂0₆ + 2 ADP + 2 Р, + 2 NADH + 2 Н⁺          >

СН₃-СН₂ - СН₂ - СООН + 2 NAD + 2 Н₂ + 2 С0₂ + 2 АТР + 2 Н₂0.

Маслянокислое брожение протекает в средах, куда ограничен доступ кислорода, при наличии субстрата в виде полисахаридов, моносахаридов, органических кислот, спирта. Наряду с масляной кислотой, диоксидом углерода, водородом маслянокислые бакте­рии могут образовывать в достаточно больших количествах и дру­гие продукты брожения. Так, Clostridium acetobutylicum при сбра­живании глюкозы вначале образует масляную кислоту. С подкис-лением среды индуцируются ферменты, в результате деятельности которых накапливаются ацетон и бутанол. Например, синтезиро­ванная в бактериальной клетке ацетоацетатдекарбоксилаза в ком­плексе с тиолазой из ацетил-СоА образуют ацетон:

Другим промежуточным продуктом в результате действия фермента Clostridium acetobutylicum является ацетальдегид, об­разующийся из ацетил-СоА. Последний при участии NADH и ал-когольдегидрогеназы восстанавливается в этанол. Этот тип бро­жения называют ацетонобутиловым.

Спиртовое, гомоферментативное молочнокислое и масляно-кислое брожения являются основными. Все другие представляют собой комбинацию этих основных. Так, гетероферментативное молочнокислое, пропионовокислое брожения можно предста­вить как комбинированное гомоферментативное молочнокислое и спиртовое; ацетонобутиловое — как маслянокислое и спирто­вое; брожение пектиновых веществ, клетчатки - разновидность маслянокислого брожения.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ, ПРОТЕКАЮЩИЕ ПРИ МЕТАБОЛИЗМЕ  МИКРООРГАНИЗМОВ В ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ПОЛУФАБРИКАТАХ

В технологии хлебобулочных изделий для обеспечения процессов спиртового брожения и гликолиза применяют хле­бопекарные прессованные дрожжи и молочнокислые бакте­рии, содержащиеся в бактериальных хлебопекарных заквас­ках. Микробиологическим процессам, протекающим под их действием в полуфабрикатах, присущи огромные потенциаль­ные возможности.

Отличительной особенностью дрожжевой клетки является— то, что структуры высшего порядка белков и нуклеиновых кислот в ней определяют ее метаболизм. В состав дрожжевой клетки вхо­дят биологически важные макромолекулы, сложная организация и воспроизведение которых способствуют ее жизнедеятельности. Следует отметить и тот факт, что все компоненты клетки (белки, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы) непрерывно изменя­ются, постоянно обновляются.

Метаболизм дрожжевых клеток и бактерий зависит от их спо­собности пропускать воду и растворенные в ней вещества, т.е. за­висит от их проницаемости. Эта способность неодинакова у дрожжевых клеток и молочнокислых бактерий. Проблема прони­цаемости имеет большое значение в механизме обмена веществ, в вопросах распределения веществ между клетками, возникнове­ния биоэлектрических потенциалов.

В основе проникновения вещества в клетку лежит процесс диффузии, математическую трактовку которого дал Фик (1955). По закону Фика, скорость диффузии dm/dt прямо пропорцио­нальна градиенту концентрации dc/dx и площади поверхности s, через которую осуществляется диффузия:

Коэффициент пропорциональности D в уравнении (6.6) но­сит название константы диффузии.

Скорость проникновения вещества в клетку определяется по формуле, предложенной Коллендером и Берлундом (Collander, Barlund):

Вычисление константы проницаемости проводят по форму­ле (6.7), которую можно представить в следующем виде:

Принимая т/с, равным v (v — объем клетки), и интегрируя, получаем:

Считая v и s постоянными в течение всего времени экспери­мента, получим:

Проникновение вещества может происходить и в направле­нии, обратном концентрационному градиенту, при наличии дру­гого градиента, противоположно направленного, например, электрического.

При исследовании проницаемости следует постоянно учиты­вать роль метаболических процессов и в обеспечении концентраци­онного градиента между клеткой и средой. Так, включение поступа­ющего в клетку аниона фосфора в молекулы нуклеотидов, нуклеи­новых кислот, нуклеопротеидов и фосфолипидов приводит к сни­жению концентрации неорганического фосфора в клетке и тем са­мым поддерживает градиент этого аниона между клеткой и средой.

Важную роль в накоплении веществ в клетке играет и хими­ческая адсорбция.

Направление потока веществ не остается раз навсегда по­стоянным: оно может измениться на обратное при нарушении соотношений между процессами синтеза и распада важнейших высокомолекулярных компонентов протоплазмы. Так, в моло­дых клетках происходит накопление ионов калия и фосфатов за счет включения последних в молекулы АТФ. Напротив, по мере старения клеток происходит распад органических фосфатов с отщеплением и последующим выходом фосфатов, а также ионов калия в среду. Иначе говоря, направление потока ве­ществ изменяется на противоположное.

При всем разнообразии строения и физико-химических свойств молекул веществ существуют в основном два пути их про­никновения в клетку: 1) через субмикроскопические заполненные водой поры, пронизывающие протоплазму и соединяющие ее с внешней средой, проникают молекулы водорастворимых веществ и ионы; 2) за счет растворения в липидах, входящих в состав прото­плазмы и особенно ее поверхностных слоев, проникают водонера-створимые органические соединения.

Проницаемость клеток для органических молекул уменьша­ется по мере возрастания количества гидроксильных, карбок­сильных и аминогрупп.

Для диффузии молекул водорастворимых соединений, при условии если их радиус не превышает радиуса гексоз, применимо уравнение Товерта:

Джекобс (М. Jacobs), исходя из современной теории электри­ческого строения молекул, показал, что все химические соедине­ния, а также отдельные, входящие в их состав радикалы, можно разбить на две большие группы:

1) электрически симметричные, т.е. те, у которых центры по­ложительных и отрицательных зарядов совпадают друг с другом, названные неполярными, или гомеополярными (метиловые, этиловые, фениловые группы);

2) электрически несимметричные, центры положительных и отрицательных зарядов которых не совпадают, - полярные или гетерополярные (соединения с группами СООН, ОН и NH₂).

Неполярные соединения хорошо растворимы в липидах, хлороформе и ацетоне, имеют низкую диэлектрическую посто­янную, а полярные хорошо растворимы в воде и характеризуются высокой диэлектрической постоянной.

Исключение из этого правила составляет глюкоза, плохо ра­створимая в липидах, но легко проникающая в клетку. Возможно, что глюкоза нарушает глобулярную структуру некоторых белков. Аномально высокая проницаемость клеток для глицерина может быть отнесена на счет его способности образовывать димеры, в ко­торых маскирующие друг друга полярные гидроксильные группы соседних молекул не препятствуют липидорастворимости.

Поступление веществ из внешней среды обеспечивают кле­точная стенка дрожжевой клетки, цитоплазматическая мембра­на, пиноцитоз и эндоплазматическая сеть.

Бактерии имеют относительно простое строение. Бактериаль­ная клетка состоит из протоплазмы (цитоплазмы) с различными включениями, которая от внешней среды отделена плотной обо­лочкой — клеточной стенкой. Стенки бактериальных клеток пред­ставляют собой жесткие, пористые, замкнутые структуры, обеспе­чивающие клеткам защиту от физических воздействий, препят­ствующие набуханию и разрыву клеточной мембраны. Клеточные стенки бактерий принимают участие во многих физиологических и физико-химических процессах, выполняя различные функции в жизни клетки. Оболочки клеток химически активны, в них проис­ходит множество химических реакций. Цитоплазматическая мембрана бактерий контролирует поступление питательных веществ и выход продуктов метаболизма из клеток.

Физико-химические процессы проницаемости дрожжевых клеток для неполярных соединений объясняются липидной структурой клеточной мембраны. Липид ведет себя как раствори­тель для неполярных участков белков, стероидов и т.д. В цитоплаз-матической мембране белковые молекулы, расположенные между слоями липидов, могут изменять свое положение. Липиды, соглас­но глобулярной структуре биомембраны дрожжей, организованы в биослои, но они не являются непрерывными (рис. 6.4).

Толщину биомолекулярного слоя можно вычислить по фор­муле Фрикке:

Расчеты, произведенные на основании опытных данных, по­казали, что толщина клеточной мембраны приблизительно равна 32 А, что соответствует бимолекулярному слою жирных кислот с длиной углеводородной цепочки в 16 - 18 углеродных атомов.

Обратите внимание на лекцию "Объектно-ориентированные CASE-средства".

В клетку могут проникать вещества, нерастворимые в липидах, в первую очередь, минеральные ионы, сахара и аминокислоты.

Для того чтобы молекула или ион водорастворимого веще­ства проникли в клетку, они должны обладать некоторым доба­вочным количеством энергии. Пересекая клеточную мембрану, они должны, во-первых, оторваться от окружающей их сольватной оболочки, во-вторых, раздвинуть плотно расположенные молекулы поверхностного слоя на границе клетка — омывающий ее раствор, в-третьих, преодолеть взаимодействие своих поляр­ных групп с полярными группами, расположенными внутри ка­нала поры, в-четвертых, преодолеть энергетический барьер на границе поверхностной мембраны и водного раствора коллоидов и ионно-дисперсных веществ протоплазмы.

Изменяя активную реакцию внешней среды, можно увели­чить или уменьшить количество недиссоциированных молекул и тем усилить или ослабить проникновение вещества в клетку.

Процессы обмена веществ в дрожжевой клетке протекают с участием биологических катализаторов, в состав которых входят экзо- и эндоферменты. Взаимосвязь дрожжевых клеток с окружа­ющей средой, приспособление к ней создают благоприятные фи­зико-химические условия и предопределяют активность их фер­ментов, ускоряют и обеспечивают внутриклеточные биохими­ческие превращения.

В условиях хлебопекарного производства факторами, влияю­щими на рациональный ход технологического процесса и каче­ство продукции, являются исходная биологическая активность дрожжевых клеток и способность их усваивать питательные ве­щества. Эффективность их усвоения зависит от ряда физико-хи­мических факторов: проницаемости клеточной мембраны, воз­никновения биоэлектрических потенциалов, величин концент­рационного и электрического градиентов, наличия водо- и нера­створимых веществ в окружающей среде, рН среды, величины энергетического барьера, активности и др. Уникальным свой­ством дрожжевой клетки является непрерывное получение энер­гии - химической, электрической, необходимой для ее метабо­лизма и физиологических функций. Энергия в клетке накаплива­ется в результате окислительно-восстановительных реакций.

Используя научные концепции метаболизма дрожжей, ко­эффициент распределения питательных веществ между клетками и окружающей средой, можно регулировать их активность при брожении хлебопекарных полуфабрикатов.