Методы оптико-спектрального анализа

Лекция №5

 Методы оптико-спектрального анализа

В практике лабораторных исследований большую группу состав­ляют методы оптико-спектрального анализа (ОСА), в которых со­став исследуемой биопробы и концентрация компонентов определя­ются на основании изучения ее оптического спектра. Они особенно эффективны при изучении молекулярного и элементного состава компонент пробы.

Все методы этой группы отличаются необходимостью предвари­тельного перевода исследуемой пробы в атомарное состояние. Извест­но большое количество способов атомизации вещества — газовое пла­мя, электроподогрев, электрическая дуга, лазер и т. п., с помощью ко­торых переводят атомы биопробы в возбужденное состояние, в резуль­тате чего они на короткие периоды времени переходят с низшего энер­гетического уровня на более высокие. При обратном их переходе на нижний уровень основного состояния происходит испускание фото­нов, в результате чего можно зарегистрировать характерный спектр испускания или поглощения лучистой энергии, по которому и судят о составе исследуемой пробы (каждому элементу соответствует свой на­бор спектральных линий). Чаще всего перевод исследуемого соедине­ния в атомный пар осуществляют путем распыления вещества в горел­ке с последующей термической диссоциацией в пламени.

Взаимодействие света с веществами – это взаимодействие свето­вого электромагнитного поля, колеблющегося с высокой частотой, с электронами, атомами и молекулами веществ, находящимися в этом поле.

Свет ведет себя как электромагнитная волна только при распространении через непоглощающие среды. В остальных случаях световой поток представляется, как поток частиц — фотонов.

Согласно молекулярной теории света, под действием электромагнит­ного поля световой волны в молекулах среды происходит смещение связующих пар внешних (оптических) электронов в сторону более элек­троотрицательного атома. Это смещение приводит к несовпадению центров положительных и отрицательных зарядов, т. е. молекулы по­ляризуются и приобретают характер диполей. Диполи совершают вы­нужденные колебания с частотой, равной частоте падающей световой волны. Кроме того, данные диполи являются источниками вто­ричных сферических волн. Если среда однородна и изотропна (свойства среды одинаковы во всех направлениях) и падающая световая волна плоская, то из-за интерференции ее со всеми вторичными волнами, излучаемыми диполями среды, получается плоская ре­зультирующая волна, которая распространяется в соответствии с за­конами преломления и отражения света. Так как распространение света в преломляющей среде связано с поляризуемостью ее молекул, то различные соединения, среды и вещества имеют разную прелом­ляющую способность.

Рефракция есть мера электронной поляризуемости вещества, ха­рактеризующая его физико-химическое состояние. Рефракцию исполь­зуют для определения состава и структуры химических соединений. Рефрактометрические методы нашли применение в лабораторной ме­дицине. Например, измерение содержания общего белка в сыворотке крови или в лиофильно высушеных биопрепаратах крови — сыворо­точном альбумине, фибриногене и др. проводят с помощью специаль­ного прибора рефрактометра.

Рекомендуемые материалы

Распространение света в среде связано с поляризуемостью моле­кул данного вещества. Под действием поля электроны атомов или молекул вещества совершают вынужденные колебания. При совпаде­нии частоты колебания поля приходящей волны и собственной час­тоты колебаний электронов возникает резонанс и поглощение света.

Зависимость фазовой скорости распространения световой волны в веществе от длины волны называют дисперсией света, или рефрактометрической дисперсией.

Интерференция наблюдается при определенных условиях при на­ложении двух или нескольких световых пучков. Интенсивность света в области перекрытия пучков имеет характер чередующихся светлых и темных полос, причем в максимумах интенсивность больше, а в минимумах меньше суммы интенсивностей пучков.

Интерференция световых волн заключается в сложении колебании частот с разными фазами.

Интерференционный светофильтр

Явление интерференции широко используется в оптической тех­нике, в частности, для изготовления интерференционных светофильтров. Интерференционный светофильтр состоит из нескольких после­довательно расположенных тончайших непоглощающих слоев из диэ­лектрических материалов — окислов , , ; фторидов , , ; сульфидов ,  и других соединений. При прохождении белого света через такую систему с многочис­ленными границами раздела свет многократно переотражается. В результате интерференции отраженных лучей с проходящими лучами (отраженные и проходящие лучи когерентны) часть светового потока ослабляется лишь незначительно, а часть—в 10— 10раз.                                                                          

Светофильтры используются в фотометрах в качестве монохроматоров.

Дифракция света — это отклонение света от прямолинейного распространения, когда свет огибает контур непрозрачных тел и, следовательно, проникает в область геометрической тени. Если на щель падает световая волна, то, фокусируя линзой свет, прошедший через щель, можно наблюдать чередование максимумов и минимумов освещенности.

Если свет падает не на одну щель, а на ряд па­раллельных щелей (решетку), то пуч­ки, испытав дифракцию на каждой щели, интерферируют между собой.

Простейшая дифракционная ре­шетка состоит из прозрачных участков (щелей), разделенных непрозрачными промежутками. На решетку направля­ется параллельный пучок света. На­блюдение ведется на непрозрачном экране в фокальной плоскости линзы,  установленной за решеткой.

В каждой точке Р на экране в фо­кальной плоскости линзы соберутся лучи, которые до линзы были парал­лельны между собой и отклонились на решетке под определенным углом θ. Для того, чтобы в точке Р на­блюдался интерференционный максимум, разность хода ∆ между вол­нами, испущенными соседними щелями, должна быть равна целому числу длин волн:

,

где d — период решетки, m — целое число, которое называется по­рядком дифракционного максимума. В тех точках фокальной плоскости линзы, для которых это условие выполнено, располагаются главные максимумы дифракционной картины.

Рис. 6.21. Дифракция света на решетке.

Решетка способна разлагать излучение в спектр, то есть она является спектральным прибором — составной частью монохроматоров (устройств для выделения монохроматического света). Если на решетку падает      немонохроматическое излучение, то в каждом порядке дифракции (то есть при каждом значении m) возникает спектр исследуемого |излучения. Одной из важнейших характеристик дифракционной решетки является ее разрешающая способность, характеризующая возможность разделения с помощью данной решетки двух близких спектральных линий с длинами волн  и . Спектральной разрешающей способностью R называется отношение длины волны  к минимальному возможному значению . Разрешение дифракционной решетки зависит только от порядка спектра m и от числа периодов решетки N.

Поляризацией света называется выделение из пучка естественной света лучей, поляризованных в определенной плоскости. В источни­ках света элементарные процессы излучения света атомами происходят независимым образом, поэтому в обычном свете оси электромагнитных волн ориентированы хаотично, и свет, испускаемый обычны ми источниками (солнечный свет, излучение ламп накаливания и т. п.) неполяризован. Неполяризованный свет называют также естественным светом.

Вещества, способные изменять (вращать) плоскость поляризации света, являются оптически активными веществами; вещества, не способные изменять плоскость поляризации света, являются оптически неактивными. Поляриметрический метод анализа основан на измерении угла вращения плоскости поляризации луча света, прошедшего через оптически активную среду, которая помещается между поляризатором и анализатором.

Глюкоза имеет ассиметричные атомы углерода, связанные с разными группировками, поэтому обладают способностью вращать плоскость поляризованного луча. На этом основано определе­ние глюкозы в моче с помощью поляриметра. Угол вращения плоскости поляризации зависит от оптической толщины раствора и концент­рации глюкозы в растворе.

Поляриметр

Основной частью любого прибора для поляриметрического анализа является источник поляризованных лучей (поляризатор) и измеритель угла поляризации (анализатор).

На рис. 6.28. приведена схема простейшего поляриметра.

Рис. 6.28. Схема простейшего поляриметра.

1 — поляризатор; 2 — пластинка бикварца; 3 — кювета с раствором; 4 — анализатор.

При использовании простейшего поляриметра анализатор настра­ивают на «темноту», вращая его вокруг продольной оси. Затем вносят в прибор кювету с исследуемой жидкостью. При этом наблюдается просветление поля окуляра вследствие вращения плоскости поляри­зации раствором. Поворачивая анализатор, добиваются нового потем­нения поля, причем угол поворота анализатора соответствует углу вра­щения раствором плоскости поляризации. Для более точного опреде­ления момента затемнения поля окуляра применяют дополнительную пластинку 2, состоящую из двух пластинок левовращающего и право­вращающего кварца (так называемая пластинка бикварца).

При ма­лейшем повороте анализатора обе половинки бикварца меняют свою окраску: одна становится синей, а другая — красной. Таким образом фиксируется малейший поворот анализатора.                                    

ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ СХЕМЫ

ИЗМЕРЕНИЯ ОПТИЧЕСКОГО ПОГЛОЩЕНИЯ

РАСТВОРОВ

Метод измерения оптического поглощения исследуемого раствора относительно раствора сравнения в одной и той же спектральной полосе излучения реализуется двумя основны­ми схемами:

1. Схемой фотометрирования с одним световым лучом (однолучевое  фотометрирование).

2.  Схемой фотометрирования с двумя световыми лучами (двухлуче-вое фотометрирование).

Однолучевое фотометрирование (рис. 8.20). Вначале измеряется сигнал фотодетектора, соответствующий величине излучения I_ст про­шедшего через раствор сравнения (стандартный раствор, холостую пробу) и кювету, содержащую этот раствор. Оптическая плотность кюветы с раствором сравнения Dсигнал  Iсвязаны соотно­шением:

.

Затем измеряется сигнал фотодетектора, соответствующий величины излучения I, прошедшего через кювету с исследуемой пробой. Оптическая плотность исследуемого раствора D сигнал  связаны соотношением:

.

Искомая плотность  равна:

.

Рассмотренная схема измерения содержит одно измерительное плечо. Чтобы измерить сигналы, соответствующие и  необходимо попеременно вводить в измерительное плечо кювету с исследуемым раствором и кювету с раствором сравнения. Такую схему называют схемой прямого фотометрирования.

Рис. 8.20. Схема однолучевого метода измерения оптической плотности иссле­дуемого раствора относительно раствора сравнения в одной и той же спект­ральной полосе излучения.

Последовательно измеряется оптическая плотность кюветы со стандартом (а) и исследуемой пробой (б).

Измерение оптической плотности проводится в одном канале пос­ледовательно. Вначале измеряется сигнал раствора сравнения (а), затем — исследуемого раствора (б). Результаты регистрируются раз­дельно, обработка производится вручную. Недостаток метода в боль­шом временном интервале между фотометрированием растворов, что приводит к погрешностям измерений из-за временной нестабиль­ности оптико-электронного тракта (источника излучения и фото­приемников).

Двухлучевое фотометрирование. Оптическая плотность исследуе­мого и сравнительного образцов измеряется одновременно в двух ка­налах. Далее могут быть различными схемы сопоставления сигналов. На рис. 8.21. показана схема, при которой сигналы поступают на 2 фотоприемника и представляются на 2-х индикаторах. Устраняется временная нестабильность источника излучения. Недостаток схемы в наличии 2-х фотоприемников, имеющих разную временную ста­бильность параметров, что приводит к погрешностям измерений.

Рис. 8.21. Схема двухлучевого фотометрирования с одним монохроматором и с двумя раздельными каналами измерения.

На рис. 8.22 представлена схема, при которой оптическая плот­ность исследуемого и сравнительного образцов измеряется одновре­менно в двух каналах, сигналы поступают на 2 фотоприемника и на устройство сравнения. Устройство сравнения может быть нуль-инди­катором, в этом случае одной из щелей добиваются выравнивания сиг­налов в 2-х каналах. Искомую величину находят по шкале на щели (ФЭК-56). В другом случае на индикатор может выводиться искомая величина.

"Что такое FTP-сервер" - тут тоже много полезного для Вас.

Рис. 8.22. Схема двухлучевого фотометрирования с одним монохроматором, с двумя фотоприемниками и устройством сравнения.

Устраняется временная нестабильность источника излучения. Не­достаток схемы в наличии 2-х фотоприемников, имеющих разную вре­менную стабильность параметров, что приводит к погрешностям из­мерений.

Рис. 8.23. Схема двухлучевого фотометрирования с «разделением» 2-х лучей во времени с одним монохроматором, одним фотоприемником и анализатором.

Схема с «разделением» 2-х лучей во времени (рис. 8.23). Два луча от монохроматора приходят на вращающийся диск с зеркальными и прозрачными секциями (переключатель лучей). Короткие импульсы 2-х лучей, разделенные во времени, поступают на один фотоприемник. Импульсные сигналы фотоприемника сравниваются анализатором и на индикатор поступает искомая величина. Устраняется временная нестабильность источника излучения и фотоприемного тракта. Наи­более точная схема измерения.