Диссертация (Влияние компонентов сигнального пути HEDGEHOG на пролиферацию и химиорезистентность низкодифференцированных глиом), страница 21

Для выявления глиом с активным сигнальным путем дополнительно к применяющимсяметодам можно использовать предложенный нами подход качественной оценки активностисигнального пути.Для оценки участия компонентов сигнального пути Hedgehog в процессах пролиферациимы впервые применили метод измерения электрического импеданса. В отличие отколориметрических методов, метод измерения электрического импеданса не оказываетнегативного воздействия на клетки, позволяет получать данные в реальном времени и длябольшого количества временных точек, что дает возможность более достоверно оцениватьучастие компонентов сигнального пути Hedgehog в процессах клеточной пролиферации.Дополнительное применение проточной цитофлуориметрии показало, что циклопамин неоказывает прямого цитотоксического действия, но уменьшает пролиферативную активностьклеток глиом и оказывает Hedgehog сигналинг-опосредованное цитотоксическое действие.Предложенное нами сочетание методов измерения электрического импеданса и проточнойцитофлуориметрии позволяет оценить влияние циклопамина на данные процессы вотдельности.Впервые применение метода измерения электрического импеданса дало возможностьпродемонстрировать, что ингибирование и стимулирование сигнального пути Hedgehogспособно оказывать влияние на чувствительность клеток линии U-251 MG к исследуемымхимиотерапевтическим препаратам.

Данный эффект не наблюдался в клетках культурыастроцитов человека. Также был показан эффект участия компонентов сигнального пути94Hedgehog в процессах формирования мультилекарственной резистентности опухолевых клеток,а также отношение к образованию клеток боковой популяции.Таким образом, есть основания сделать вывод о том, что эксперименты с использованиемShh,циклопаминаихимиотерапевтическихпрепаратовпозволяютполучатькакдополнительную информацию об активности сигнального пути, так и применяться дляизучения механизмов влияния компонентов сигнального пути на пролиферацию и процессыхимиорезистентности к тем или иным химиотерапевтическим препаратам.

Нет сомнений в том,что дальнейшая разработка методов количественной оценки активности сигнального путиНedgehog и оценки влияния его компонентов на химиорезистентность опухолевых клеток кразличным препаратам поможет в разработке эффективной комбинации его ингибиторов итрадиционных схем химиотерапии, что будет способствовать развитию персонифицированнойтерапии пациентов.95Выводы1.tGLI1 экспрессируется только в клетках линии U-87 MG. Экспрессия GLI1 в клетках линийглиом превышает экспрессию в клетках культуры астроцитов человека. Экспрессия GLI1 впервичных образцах глиом не превышает экспрессию GLI1 в первичных образцах здоровойткани мозга. Судить о влиянии транскрипционных факторов GLI1 и tGLI1 на процессыпролиферации и химиорезистентности только при помощи ПЦР в реальном времениневозможно.2.Shh стимулирует пролиферацию клеток линии U-251 MG и культуры астроцитов человека,но не оказывает влияния на клетки линии U-87 MG.

Циклопамин уменьшает пролиферациюклеток линий U-251 MG и U-87 MG, но не влияет на пролиферацию клеток культурыастроцитов человека.3.Циклопамин в концентрациях 5 и 10 мкМ не оказывает прямого цитотоксического действияна клетки линий глиом и культуры астроциты человека, но оказывает Hedgehog сигналингопосредованное цитотоксическое действие на клетки линий глиом.4.Качественная оценка активности сигнального пути Hedgehog в клетках линий глиом иклетках культуры астроцитов человека позволяет продемонстрировать активациюсигнального пути в клетках линий глиом и неактивное состояние в клетках культурыастроцитов человека.5.Компоненты сигнального пути Hedgehog способны оказывать влияние на процессыформирования химиорезистентности. Циклопамин снижает химиорезистентность клетоклинии U-251 MG к цисплатину, темозоломиду и доксорубицину.

Shh увеличиваетхимиорезистентность клеток линии U-251 MG к цисплатину и доксорубицину, но нетемозоломиду. Циклопамин и Shh не оказывают влияния на химиорезистентность клетоккультуры астроцитов человека.6.Сигнальный путь Hedgehog принимает участие в формировании фенотипа клеток боковойпопуляции линий U-251 MG и U-87 MG.96Список сокращений и условных обозначенийABC – белковое суперсемейство переносчиков, содержащих АТФ-связывающий домен (ABCB1– он же Р-гликопротеин, ABCC1 –он же MRP1 – белок множественной лекарственнойрезистентности 1, ABCC2, ABCG2, ABCC3, ABCA2)Ang-1 – ангиопоэтин 1Ara-C – цитозин арабинозид, он же цитарабинATP7B – бета-полипептид медь-переносящей АТФ-азыATR/Chk1 – сигнальный путь, где ATR – атаксия-телеангиэктазия и Rad3-родственный белок,серин-треониновая протеинкиназа, Chk1 – чекпойнт-киназа 1Bcl-2 – семейство регуляторов апоптоза (от B-cell lymphoma 2)BCRP – ген, кодирующий ABCG2 переносчикbFGF – основной фактор роста фибробластов, он же FGF-2BHLHE41 – димеризующийся фактор транскрипции Е41Bmi-1 – белок группы polycomb, кодируемый геном BMI1 (B cell-specific Moloney murineleukemia virus integration site 1)Boc – трансмембраный рецептор (Brother of Cdo), кодируемый геном BocBTP-Cul3 - убиквитин-лигаза BTP-Cul3, BTP – 2,6-бис (1,2,3-триазол-4-ил) пиридин, Cul3 –cullin3C’ΔGLI1 – транскрипционный фактор, мРНК которого является продуктом альтернативногосплайсинга гена GLI1CD133 – проминин-1CD24 – кластер дифференцировки 24Cdc2 – ген, кодирующий циклинзависимую киназу 1Cdc20 – ген, кодирующий белок цикла клеточного деления 20Cdc25a – ген, кодирующий фосфатазу, обладающую двойной специфичностью (белок циклаклеточного деления 25а)97Cdc25c – ген, кодирующий фосфатазу Сdc25c (белок цикла клеточного деления 25с)Cdk2 – ген, кодирующий циклинзависимую киназу 2Cdon – трансмембраный рецептор, кодируемый геном Cdonc-JUN – транскрипционный фактор, кодируемый геном JUNC-MYC – транскрипционный фактор семейства MycCtBP2 – ген, кодирующий С-концевой связывающий белок 2 (C-terminal binding protein 2)CTR1 – траснпортер меди 1CYR61 – богатый цистеином белок 61DCV – DyeCycle Violet, флуоресцентный красительDhh – ген полипептида Desert hedgehogDMEM – среда Игла, модифицированная ДульбеккоDMEM/F-12 – среда DMEM и F-12 в соотношении 1:1DMSО - диметилсульфоксидDPBS – фосфатно-солевой буферный раствор ДульбеккоDTT – дитиотреитолE2F2 – ген, кодирующий транскрипционный фактор Е2F2 семейства E2FEGF – эпидермальный ростовой факторEGFR – рецептор эпидермального ростового фактораERCC1 – ген, кодирующий белок ERCC1, принимающий участие в репарации ДНКEWS/FL1 – транскрипционный фактор семейства саркомы ЮингаEXO1 – ген, кодирующий экзонуклеазу 1FEN1 – ген, кодирующий флэп(шлепающую)-эндонуклеазу 1FGF – семейство факторов роста фибробластовGAPDH – ген, кодирующий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназуGas1 – блокирующий рост специфический белок 198GLI – семейство транскрипционных факторов GLI (глиома-ассоциированный онкоген )иодноименных генов, существуют GLI1, GLI2, GLI3 транскрипционные факторыGLI1ΔN – транскрипционный фактор, мРНК которого является продуктом альтернативногосплайсинга гена GLI1HBSS – сбалансированный солевой раствор ХэнксаHEPES – 4-(2-Гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислотаHH – Hedgehog сигнальный путьHHIP - гликопротеин Hedgehog interacting protein, кодируемый геном HHIPHIF-1α – ген, кодирующий фактор, индуцируемый гипоксией 1-альфа (HIF-1α)IDH1 и IDH2 – изоцетратдегидрогеназа 1 и 2, кодируемые одноименными генамиIGF-1 – инсулиноподобный фактор роста 1IGFBP – семейство белков, связывающих инсулиноподобный фактор ростаIhh – ген полипептида Indian hedgehogIL-1β – интерлейкин-1βIL-4 – интерлейкин 4IL-6 – интерлейкин-6KIAA0101 – ген, кодирующий фактор, связывающий ядерный антиген пролиферирующихклеток (PCNA)Ku70 – белок, участвующий в репарации ДНКLIF – ингибирующий фактор лейкемииLIG1 – ген, кодирующий ДНК лигазу 1MDR1 – ген, кодирующий ABCB1 переносчикMGMT – O6-Метилгуанин-ДНК-метилтраснферазаMMLV RT – обратная транскриптаза вируса лейкемии мышейMMP-2, MMP-9 – матриксные металлопротеиназы 2 и 9MSH6 – ген, кодирующий белок MSH6, участвующий в репарации99mSin3A – белок, регулятор транскрипции, взаимодействующий с SAP18MT1-MMP – мембрано-связанная матриксная металлопротеинназаmTOR – протеинкиназа, мишень рапамицина млекопитающих (mamalian target of rapamycin)NANOG – ген, белок которого является транскрипционным фактором, регулирующимсамообновление стволовых опухолевых клетокNCBI – национальный центр биотехнологической информацииNF-kB – транскрипционный фактор и одноименный сигнальный путьNOD2 – внутриклеточный рецептор и одноименный сигнальный путьNotch – сигнальный путь и семейство трансмембранных белков человека NotchOCT1/2/3 – органические транспортеры катиона 1/2/3OCT4 – транскрипционный факторp53 – транскрипционный фактор, регулирующий клеточный циклp-ATM – серин-треониновая протеинкиназа, активированная двунитевыми разрывами ДНКPCNA – ядерный антиген пролиферирующих клетокPDGF – тромбоцитарный фактор ростаPDGFR – рецептор тромбоцитарного фактора роста и одноименный сигнальный путьPI – йодистый пропидийPI3K-AKT – сигнальный путь, где основные компоненты PI3K (фосфоинозитид-3-киназа) иАКТ-киназы (протеинкиназы В, кодируемые генами AKT)PKA – протеинкиназа АPKCα – протеинкиназа С альфаPKCδ – протеинкиназа С дельтаPTCH1 – трансмембранный рецептор Patched 1PTCH2 – трансмембранный рецептор Patched 2PTEN – фосфатаза с двойной субстратной специфичностью (phosphatase and tensin homolog)RAD51/51C – гены, кодирующие белки семейства RAD51, участвующие в репарации ДНК100RAD54B/L – гены, кодирующие белки RAD54B/L, участвующие в репарации ДНКRas – сигнальный путь и семейство малых G-белков и их генов, впервые обнаруженных у крысс саркомой (Rat sarcoma)RPE – буфер для элюции фирмы QiagenRWT – буфер для промывки фирмы QiagenS100A4 – S100 кальций связывающий белок A4SAP18 –– гистон деацетилазный комплексSDF-1 – фактор стромальных клеток 1 (Stromal cell-derived factor 1)Shh – ген, кодирующий полипептид Sonic hedgehog (Shh)SMO - трансмембранный рецептор SmoothenedSnail1 – транскрипционный фактор семейства Snail, регулирует эпителиально-мезенхимальныйпереходSOX2 –транскрипционный фактор (sex determining region Y-box 2)SP – клетки боковой популяцииSUFU – белок, кодируемый геном SUFU (Supressor of fused)TBE – буфер, содердащий трис, борат и ЭДТАTEM7 – ген, кодирующий опухолевый эндотелиальный маркер 7TERT – ген, кодирующий теломеразную обратную транскриптазу TERTTGF-β-Smad–сигнальныйпуть(TGF-β–трансформирующийростовойфактор β,активирующий белки семейства Smad – гомологи протеинов Sma (от small - малый) и MAD(mothers against decapentaplegic))tGLI1 – транскрипционный фактор, мРНК которого является продуктом альтернативногосплайсинга гена GLI1TM4SF – суперсемейство белков тетраспанинов (transmembrane 4 superfamily)TNF-α – фактор некроза опухоли-αTP53 – ген, кодирующий белок p53Tsp-1 – тромбоспондин-1101Twist – транскрипционный фактор, кодируемый геном TWIST1UNG – ген, кодирующий урацил-ДНК-гликозилазуVEGF – семейство факторов роста эндотелия сосудовVEGF-C – ген, кодирующий фактор роста эндотелия сосудов CVEGFR3 – рецептор 3 фактора роста эндотелия сосудовVEGF-А – ген, кодирующий фактор роста эндотелия сосудов АWnt – группа сигнальных путей и семейство белков, (комбинация Wingless (бескрылый) и Int)XPD – ген, кодирующий XPD хеликазу, участвующую в репарации ДНКXRCC1 – ген, кодирующий белок XRCC1, участвующий в репарации ДНКXTT – 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолиум-5-карбоксанилидβ-TRCP – убиквитин-лигаза β-TRCP (beta-transducin repeat containing protein), β-TRCP Е3 –разновидность убиквитин-лигазыВОЗ – Всемирная организации здравоохраненияКИ – клеточный индексПЦР – полимеразная цепная реакцияПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времениЭБС – эмбриональная бычья сывороткаЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислотаЭМП – эпителиально-мезенхимальный переход102Список литературы1.Harder, B.