Диссертация (Влияние компонентов сигнального пути HEDGEHOG на пролиферацию и химиорезистентность низкодифференцированных глиом), страница 20

19 г, 20 б, г, е). Таким образом, предварительное культивирование астроцитовс Shh не приводило ни к изменению времени начала гибели клеток, ни к увеличению клеточнойпролиферации после смены среды. В противном случае, период времени до начала гибеликлеток при предварительном культивировании с Shh оказался бы больше. Также данныйэксперимент свидетельствует в пользу того, что на время, через которое начинают погибатьклетки не влияет количество клеток в момент замены среды на среду с химиотерапевтическимпрепаратом.Любопытно, что при предварительном культивировании астроцитов с лигандом Shh неотмечалось разницы во времени начала гибели клеток. Из этого следует, что активациясигнального пути приводит к стимуляции пролиферации, но не влияет на чувствительностьклеток к химиотерапевтическим препаратам.

Что касается предварительного культивированияастроцитов с циклопамином в концентрации 5 и 10 мкМ, то оказалось, что циклопамин невлияет ни на процессы пролиферации, ни на чувствительность клеток к химиотерапевтическимпрепаратам.Такимобразом,ингибированиесигнальногопутивклеткахглиомповышаетхимиочувствительность клеток, в то время как внесение активатора НН сигнального путиснижаетхимиочувствительность.СледовательносигнальныйпутьННвлияетнахимиорезистентность клеток глиом.Одним из показателей, по которому судят о химиорезистентности тех или иных культурклеток и клеточных линий, является процент клеток боковой популяции. Этот показательполучают при окрашивании клеток флуоресцентными витальными красителями Hoechst 33342или DCV.

Первоначально методика была разработана для красителя Hoechst 33342, и лишь впоследние годы в лабораториях стал активно использоваться краситель DCV (первые статьи с90его использованием индексированы в Pubmed в 2007 году). Дело в том, что эти красителиявляются субстратами для ABC переносчиков, в результате чего клетки, отличающиесяповышенной презентацией данных транспортеров, активно выкачивают красители из мембраныи при цитофлуориметрическом анализе характеризуются меньшим уровнем флуоресценции,чем остальная популяция клеток [260, 264, 265]. Название “боковая популяция” происходит отрасположения данной популяции клеток сбоку и ниже от основной популяции клеток надвумерных точечных диаграммах (рис.

22).В нашей работе для определения процента клеток боковой популяции мы использовалиDCV, так как на приборе был установлен фиолетовый лазер (с длиной волны 407 нм), а неультрафиолетовый, необходимый для красителя Hoechst 33342, чаще применяющийся в такихэкспериментах.

Нашей задачей не являлось сравнение данных процента клеток боковойпопуляции с данными мировой литературы при использовании Hoechst 33342. Мы изучаливлияние сигнального пути на мультилекарственную резистентность.Нами было показано, что культивирование клеток линий глиобластом U-87 MG иU-251 MG с циклопамином приводит к дозозависимому уменьшению процента клеток боковойпопуляции в сравнении с контролем, где клетки культивировались только в присутствииDMSO.

Мы не проводили тест по оценке влиянии лиганда Shh на боковую популяцию из-заограниченной возможности использования данного препарата в необходимом количестве.Таким образом, из результатов, полученных с применением ингибитора сигнального путициклопамина следует, что сигнальный путь принимает участие в формировании клеток боковойпопуляции, то есть влияет на мультилекарственную резистентность, обусловленную ABCпереносчиками.Так как разные белки семейства ABC могут препятствовать проникновению красителяDCV в клетку, то мы не можем судить о том, на какие конкретно ABC переносчики влияет ННсигналинг, а на какие не влияет.

Для более прицельного выяснения влияния сигнального путина конкретные переносчики необходимо применение либо молекулярно генетических методов,либо применение специфических к конкретному переносчику ингибиторов другого класса [195,256]. Но в мировой литературе отмечается, что большой вклад в формирование боковойпопуляции вносят ABCG2 переносчик. Также вклад могут вносить ABCB1 (P-гликопротеин),ABCC1 (MRP-1), ABCC3, ABCA2 и другие переносчики [266, 267].О влиянии НН пути на формирование фенотипа боковой популяции при раке яичников,желудка,легких,саркомах,мезотелиомеидругихонкологическихзаболеванияхсвидетельствует ряд работ [206, 263, 268-270]. А для назофарингеальной карциномы было91показано, что в клетках боковой популяции повышена экспрессия GLI1, GLI2 и PTCH1 генов, атакже генов сигнальных путей Notch, TGFβ и Wnt [271].Так как НН сигналинг влияет на фенотип клеток боковой популяции, то можнопредположить, что активность сигнального пути отличается не только между клеточнымилиниями и первичными культурами клеток, но может отличаться и между клетками однойкультуры.Не возникает сомнений в том, что активный сигнальный путь Hedgehog можетрассматриваться в качестве терапевтической цели при лечении низкодифференцированныхглиом.

Это будет способствовать как снижению роста опухоли, так и преодолениюмножественной лекарственной резистентности.Для наиболее эффективного лечения онкологических заболеваний, в том числе глиом,терапия НН сигналинг-зависимых или НН сигналинг-независимых опухолей должна отличаться[16]. Поэтому перед исследователями встает актуальная проблема оценки активностисигнального пути. Оценка экспрессии GLI1, использование репортерного гена люциферазы,иммунофлуоресцентные методики по определению ядерной локализацииGLI1 даютпротиворечащие друг другу результаты.

Мы предлагаем оценивать активность сигнальногопути не по количеству и локализации GLI1 или экспрессии его гена и его сплайсинговыхвариантов, а по влиянию сигнального пути на клеточную пролиферацию, то есть на тотпроцесс, на который активный сигнальный путь оказывает влияние.В настоящий момент мы предложили только качественную оценку активностисигнального пути. При этом мы отталкивались от результатов не только с использованиемциклопамина, но и лиганда Shh, что позволило нам сделать предположение о большей илименьшей активности сигнального пути в клеточных линиях U-87 MG и U-251 MG,соответственно.

Отсутствие эффекта на внесение циклопамина, но увеличение пролиферациипри добавлении Shh было расценено нами как неактивное молчащее состояние сигнальногопути в клетках культуры астроцитов. Возможно, клетки других культур человека будутнаходиться в неактивном состоянии, при котором не будет отмечаться эффект ни отциклопамина, ни от лиганда Shh.Необходимо отметить несомненное преимущество методики измерения электрическогоимпедансапередклассическимиколориметрическимиметодами.Вотличиеотколориметрических методов, метод измерения электрического импеданса не оказываетнегативного воздействия на клетки, позволяет получать данные в реальном времени и длябольшого количества временных точек, что дает возможность делать более достоверные92выводы о клеточных процессах. В случае использования классических колориметрическихметодов, оценка пролиферации в разные временные точки была бы более трудоемкой иресурсозатратной.Дальнейшее эксперименты с применением Shh и циклопамина, а также методики оценкижизнеспособности клеток как стандартных линий глиом, так и первичных культур, для которыхпоканесуществуетоднозначнойстратегииоценкиННсигналинга,позволяткакусовершенствовать качественные критерии, так и разработать количественные критерии оценкиактивности сигнального пути.

Применение антител и ингибиторов к различным компонентамсигнального пути позволит точнее установить влияние данных компонентов на активность ифункционирование сигнального пути НН. Это позволит более полно понять роль сигнальногопути в глиомагенезе и выделить НН-зависимые и НН-независимые популяции опухолей, чтобудет способствовать подбору адекватной индивидуальной терапии.Мы впервые при помощи методики измерения электрического импеданса оцениливлияние сигнального пути НН на химиорезистентность клеток глиом.

По влиянию ННсигналинга на химиорезистентность сложнее делать предположение об активности пути, чем пооценке пролиферации. Но при помощи данных экспериментов можно будет получатьдополнительную информацию об активности сигнального пути и изучать механизмы влияниясигнального пути на процессы химиорезистентности к тем или иным химиотерапевтическимпрепаратам. Так, отсутствие влияния циклопамина и лиганда Shh на клетки астроцитовподтверждало предположение о неактивном молчащем состоянии НН сигналинга. Влияние жеданных веществ на клетки U-251 MG, напротив, подтверждало активность сигнального пути.Дальнейшие эксперименты с клетками первичных культур позволят выявлять наиболееэффективную комбинацию цитостатического препарата и ингибитора сигнального пути как наклеткахглиом,такинаклеткахдругихопухолей,чтобудетспособствоватьсовершенствованию персонифицированной медицины с индивидуальным подходом к каждомуконкретномупациенту.Этовсвоюочередьбудетспособствоватьувеличениюпродолжительности жизни, а возможно и полному выздоровлению от таких сложныхонкологических заболеваний, которыми являются низкодифференцированные глиомы.93ЗаключениеНе вызывает сомнений участие сигнального пути Hedgehog в развитии рядаонкологических заболеваний, в том числе и злокачественных опухолей головного мозга.

Обактивности сигнального пути не всегда верно судить по экспрессии GLI1 – гена основногокомпонента сигнального пути. В то время как одни авторы пытаются подобрать оптимальныйметоддляоценкиактивностисигнальногопути,другиеавторыоцениваютегонепосредственное влияние на клеточные процессы. В работе мы показали, что компонентысигнального пути Hedgehog достоверно влияют на пролиферацию и химиорезистентностьклеток низкодифференцированных глиом. Нет сомнений в том, что компоненты сигнальногопутимогутрассматриватьсявкачествепатогенетическихмишенейпритерапиинизкодифференцированных глиом, но только в подгруппе Нedgehog сигналинг-зависимыхглиом.