Диссертация (Влияние компонентов сигнального пути HEDGEHOG на пролиферацию и химиорезистентность низкодифференцированных глиом)

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшегообразования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имениН.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииНа правах рукописиЧерепановСергей АлександровичВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ HEDGEHOG НАПРОЛИФЕРАЦИЮ И ХИМИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬНИЗКОДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ГЛИОМСпециальность: 03.01.04 – БиохимияДиссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:академик РАН, профессор,доктор медицинских наукЧехонин Владимир ПавловичМосква 20192ОглавлениеОглавление ....................................................................................................................................

2Введение ........................................................................................................................................ 4Глава 1. Обзор литературы ........................................................................................................ 101.1 Опухоли головного мозга ................................................................................................

101.2 Сигнальный путь Hedgehog ............................................................................................ 131.2.1 Классический сигнальный путь Hedgehog ............................................................. 141.2.2 Неканонический сигнальный путь Нedgehog ........................................................ 181.3 Заболевания, связанные с нарушениями сигнального пути Hedgehog .......................

191.4 Особенности функционирования сигнального пути Hedgehog при глиомах ............ 201.5 Ингибирование и активация сигнального пути Hedgehog ........................................... 231.6 Влияние сигнального пути Hedgehog на ключевые процессы онкогенеза ................ 251.6.1 Влияние сигнального пути Hedgehog на пролиферацию клеток .........................

261.6.2 Влияние сигнального пути Hedgehog на эпителиально-мезенхимальныйпереход, миграционную и инвазивную активность, метастазирование и стволовыеопухолевые клетки ......................................................................................................................

281.6.3 Влияние сигнального пути Hedgehog на процессы ангиогенеза ......................... 301.6.4 Влияние сигнального пути Hedgehog на процессы сопротивления клеточнойгибели ........................................................................................................................................... 321.6.5 Влияние сигнального пути Hedgehog на другие процессы канцерогенеза......... 38Глава 2. Материалы и методы ................................................................................................... 432.1 Реактивы, расходные материалы, клеточные линии и их культивирование ..............

432.2 Препараты ингибирования и активации сигнального пути Нedgehog........................ 442.3 Химиотерапевтические препараты ................................................................................. 442.4 Выделение суммарной РНК и синтез кДНК.................................................................. 452.5 Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени ............................... 472.6 Анализ пролиферации и жизнеспособности клеток с использованием технологииизмерения электрического импеданса ...........................................................................................

4932.7 Оценка жизнеспособности клеток при помощи проточной цитофлуориметрии ...... 512.8 Определение процента клеток боковой популяции ...................................................... 532.9 Работа с литературой ....................................................................................................... 552.10 Статистическая обработка полученных результатов .................................................

55Глава 3. Результаты .................................................................................................................... 573.1 Оценка уровня экспрессии GLI1 и tGLI1 ....................................................................... 573.2 Изучение влияния сигнального пути Hedgehog на пролиферацию клеток ................

583.3 Изучение цитотоксического действия циклопамина .................................................... 643.4 Изучение влияния сигнального пути Hedgehog на химиорезистентность клеток ..... 673.5 Изучение влияния сигнального пути Hedgehog на формирование фенотипа клетокбоковой популяции .......................................................................................................................... 73Глава 4.

Обсуждение .................................................................................................................. 76Заключение .................................................................................................................................. 93Выводы ........................................................................................................................................ 95Список сокращений и условных обозначений......................................................................... 96Список литературы ................................................................................................................... 1024ВведениеАктуальностьМультиформнаяглиобластома–самаязлокачественнаяизпервичныхнейроэпителиальных опухолей головного мозга.

Средняя продолжительность жизни послепостановки диагноза не превышает 12 – 15 месяцев. Рецидивы заболевания возникаютпрактически в 100 % случаев после лечения. Из-за высокой инвазивности опухоли, локализациив жизненно важных областях головного мозга и гетерогенности ее клеточной популяциисуществующие методы терапии, такие как резекция опухоли и радиотерапия малоэффективны.Терапиятемозоломидомидругимихимиотерапевтическимипрепаратамитакжемалоэффективна, так как мигрирующие клетки перестраивают свой клеточный цикл истановятся нечувствительными к данным препаратам, оказывающим цитотоксический эффектна активно пролиферирующие клетки [1-3].Для создания более результативных и специфичных методов терапии требуется ясноепонимание частных механизмов онкогенеза, поиск конкретных мишеней среди белковсигнальных путей, принимающих участие в возникновении и развитии опухоли. Сигнальныепути, задействованные в эмбриональном развитии, регуляции пролиферации и миграции, почтивсе так или иначе задействованы в онкогенезе и глиомагенезе в частности.

Большое количествоисследований посвящено проонкогенным свойствам таких путей, как: PI3K-AKT, Ras, TGF-βSmad, Wnt, Notch и другим сигнальным путям [4-6]. Все больше появляется исследований,акцентирующих внимание на возможном вовлечении в онкогенез вообще и в глиомагенез вчастности сигнального пути Hedgehog (HH) [7-9].Интерес исследователей к сигнальному пути HH обусловлен, прежде всего, тем, чтоитоговые компоненты сигнального пути, к которым относят семейство транскрипционныхфакторов GLI, наиболее важным из которых является GLI1, влияют на множество клеточныхпроцессов.

К этим процессам относят пролиферативную, миграционную и инвазивнуюактивность, ангиогенез, нарушение клеточного метаболизма, антигенная мимикрия и другие.Дисбаланс в работе этих процессов приводит к бесконтрольному размножению и аномальномуфункционированию клеток, что вызывает развитие онкологического заболевания. Известно, чтосигнальный путь НН может активно функционировать в популяциях стволовых опухолевыхклеток, а белки сигнального пути НН взаимодействуют с белками других сигнальных путей [1013].5До сих пор окончательно не ясна роль некоторых основных компонентов сигнальногопути НН.

В процессе исследования обнаруживают новые изоформы компонентов НН пути,которые присутствуют не во всех опухолевых клетках и не при всех опухолевых заболеваниях[13-15]. НН сигналинг по-разному влияет на клеточные процессы при разных онкологическихзаболеваниях. Кроме того, сигнальный путь НН не одинаково функционирует при одних и техже злокачественных заболеваниях. Исследователи допускают существование НН сигналингзависимых и независимых глиобластом, отличающихся активностью сигнального пути [16, 17].Все эти факторы указывают на многообразие уровней функционирования сигнального пути исложность его изучения.Неоспоримо, что модулирование активности НН сигнального пути при помощиспецифических ингибиторов, поиском которых занимаются различные фармакологическиекомпании, будет способствовать созданию новых средств терапии как глиом, так и другихзлокачественных новообразований.

Однако применение ингибиторов НН сигнального пути вподгруппе НН-независимых опухолей, в том числе и глиом может дискредитировать этоперспективное направление разработки новых противоопухолевых препаратов. Тема оценкиактивности сигнального пути НН не до конца проработана. Поэтому необходима разработкакритериев, по которым можно было бы оценить активность НН пути в клеточных линиях ипервичных образцах опухолей, полученных после оперативного лечения. А изучение влияниясигнального пути на те или иные клеточные процессы, что также малоизученно, в первуюочередь на пролиферативную активность и химиорезистентность, позволит оптимальноподбирать соответствующую терапию. Развитие данного направления будет способствоватьсозданию персонифицированных подходов в терапии как глиом, так и других онкологическихзаболеваний.Цель работы:Изучение влияния сигнального пути Hedgehog на пролиферацию и химиорезистентностьнизкодифференцированных глиом на модели клеточных линий мультиформной глиобластомычеловека U-251 MG и U-87 MG.Задачи:1.Оценить экспрессию генов транскрипционных факторов GLI1 и tGLI1 в клетках глиомчеловека линий U-251 MG, U-87 MG, клетках культуры астроцитов человека, в первичных6послеоперационных образцах глиом и образцах здоровой ткани мозга.

ОценитьвозможностиПЦРтранскрипционныхвреальномфактороввремениGLI1идляtGLI1потенциальногоанализанапролиферациипроцессывлиянияихимиорезистентности.2.Оценить влияние Shh и циклопамина на пролиферацию клеток глиом человека линий U251 MG, U-87 MG и клеток культуры астроцитов человека.3.Оценить цитотоксическое действие циклопамина на клетки глиом человека линий U251 MG, U-87 MG и на клетки культуры астроцитов человека.4.Качественно оценить активность сигнального пути Hedgehog в клетках глиом человекалиний U-251 MG, U-87 MG и в клетках культуры астроцитов человека.5.Оценить влияние Shh и циклопамина на химиорезистентность клеток к цисплатину,темозоломиду и доксорубицину.6.Оценить влияние сигнального пути Hedgehog на формирование фенотипа клеток боковойпопуляции.Научная новизнаВпервые для оценки влияния сигнального пути HH на пролиферацию клеток глиобластомчеловека линий U-87 MG и U-251 MG был использован метод измерения электрическогоимпеданса.

Предложенное нами сочетание применения методов измерения электрическогоимпеданса и анализа процента погибших и апоптотических клеток с помощью проточнойцитофлуориметриипозволилодифференцироватьННсигналинг-опосредованноецитотоксическое действие ингибитора сигнального пути циклопамина и его действие напролиферацию клеток низкодифференцированных глиом. Полученные данные были примененыдля качественной оценки активности сигнального пути.