Диссертация (Влияние компонентов сигнального пути HEDGEHOG на пролиферацию и химиорезистентность низкодифференцированных глиом), страница 12

После измерения начальногосопротивления, плашку извлекали из прибора и в лунки вносили 90 мкл суспензии клеток вростовой среде. Количество клеток подбиралось отдельно для каждой культуры, что будетописано в главе результаты. После этого к 190 мкл, содержащимся в лунке, вносили 10 мкл 20-икратного раствора соответствующей испытуемой концентрации препарата (лиганд Shh илиингибитор сигнального пути циклопамин). В случае контрольных образцов вносили 10 мклкультуральной среды или культуральной среды с DMSO. Для уменьшения испарения в лункахпространства между ними заполняли DPBS.

Буфер вносили аккуратно, избегая попаданиякапель в лунки. В качестве контроля на изменение начального сопротивления, связанного сиспарением, две лунки заполняли только 200 мкл ростовой среды. Результаты первых серийопытов показали, что значимого изменения сопротивления, вызванного испарением ненаблюдается, после чего данный контроль был исключен из экспериментов. Заполненнаяплашка помещалась в прибор. Через 15 минут, когда температура в лунках достигала 37˚C, абольшинство клеток оседало на дно, начинали измерения.

Измерения выполнялись каждые 15минут минимум в течение 50 часов. На приведенных диаграммах результаты измерения длянаглядности отображаются через каждые 120 минут. Все измерения выполняли в 3-х повторах.Данные влияния лиганда Shh и циклопамина представлены в виде среднего с планкамипогрешностей, отображающими стандартное отклонение.Вторая часть работы на приборе xCELLigence была посвящена изучению влиянияциклопамина и лиганда Shh на гибель клеток при воздействии химиотерапевтическихпрепаратов. В соответствии с описанным выше протоколом, клетки культивировали в течениедвух суток в присутствии активатора или ингибитора HH пути. Для клеток, которыекультивировали в присутствии циклопамина, контролем служили клетки, растущие в среде сдобавлением 0,2% DMSO. Для клеток с лигандом Shh использовался контроль с внесениемкультуральной среды.Через 2 дня E-плашку извлекали из прибора, переносили в ламинар и пипеткой на 200 мклотбирали среду из лунок.

Носик пипетки при этом ни в коем случае не должен касаться дналунки с нанесенными золотыми микроэлектродами. Последовательно удаляли среду из трехпараллельных лунок, являющихся одной точкой эксперимента. При такой манипуляцииисключался шанс контаминации клетками, культивированными при других условиях, ивысыхание клеток. Затем в эти лунки вносили по 200 мкл среды с определенной концентрациейхимиотерапевтического препарата.

Внесение среды производили с небольшой скоростьюпипеткой на 200 мкл на стенку лунки, тем самым мы предотвращали смывание клеток со дналунки, что способствовало бы уменьшению сопротивления при продолжении эксперимента.51Дополнительно ставили контроль, в котором клетки двое суток росли в среде без циклопаминаи DMSO, после чего среду меняли на свежую.Измерения в этой части работы выполняли в 3-х повторах минимум в течение 120 часов.Кривые скорости пролиферации клеток до внесения химиотерапевтического препаратаполностью соответствуют результатам, полученным в первой части работы, поэтому, значенияклеточного индекса на графиках представлены в виде среднего без планок погрешностей состандартным отклонением.

Влияние ингибитора или активатора на химиорезистентностьоценивали по времени, когда начиналась гибель клеток после внесения химиотерапевтическогопрепарата, то есть в то время, когда КИ имел максимальное значение.2.7 Оценка жизнеспособности клеток при помощи проточной цитофлуориметрииОценка жизнеспособности клеток с определением процента погибших клеток и клеток всостоянии апоптоза проводилась при помощи набора Alexa Fluor 488 annexin V/Dead CellApoptosis Kit (Thermo Fisher Scientific, США), который включал в себя 5-Х аннексинсвязывающий буфер, йодистый пропидий (PI 1 мг/мл) и Alexa Fluor 488 меченый аннексин V. Вработе применяли 1-Х аннексин-связывающий буфер (5-Х аннексин-связывающий буферразводили в 5 раз в деионизированной воде) и рабочий раствор йодистого пропидия (1 мг/млйодистого пропидия разводили 1-Х аннексин-связывающим буфером до 100 мкг/мл ).

Припомощийодистогопропидия,являющегосяинтеркалирующимкрасителемвозможноопределение погибших клеток. Аннексин V способен связываться с фосфатидилсерином,присутствующим на мембранах клеток, находящихся в состоянии апоптоза.Клетки высаживали в 12-луночные плашки (Costar, США). Так как результаты в данномтесте сравнивались с результатами тестов измерения электрического импеданса, мывоспроизводили аналогичные условия. Поскольку площадь дна лунки в 12-луночной плашке в20 раз больше площади дна лунки в Е-плашке, мы высаживали в 20 раз больше клеток (0,1*106клеток астроцитов человека, 0,2*106 клеток линии U-251 MG, 0,4*106 клеток линии U-87 MG) и,соответственно, увеличивали объем среды (4 мл/лунку).

Для клеток культуры астроцитовчеловека использовали концентрацию циклопамина 5 мкМ, 10 мкМ и 20 мкМ. При этомколичество препарата на число клеток соответствовало таковому в Е-плашках. Клеткиастроцитов человека и U-251 MG росли 50 часов, а клетки U-87 MG – 60 часов, чтосоответствовало времени анализа КИ в экспериментах с измерением электрического импеданса.В контроле клетки астроцитов человека и U-251 MG культивировали с 0,2% DMSO (контроль52для образцов с 5 и 10 мкМ циклопамина) и с 0,4% DMSO (контроль для образцов с 20 мкМциклопамина).

Клетки U-87 MG в контроле культивировали в присутствии 1,6% DMSO(контроль для образцов с 5 и 10 мкМ циклопамина). Все измерения выполняли в 3-х повторах.По окончании времени культивирования среду отбирали, клетки промывали DPBS (Gibco,США), снимали с пластика, используя Tripsyn-EDTA (Gibco, США). Клетки центрифугировалипри 400g (Eppendorf centrifuge 5810R, Германия) в течение 5 минут, после чего супернатантотбирали и клетки ресуспендировали в 1 мл холодного DPBS. Суспензию переносили впробирки на 1,5 мл.После этого клетки повторно центрифугировали, супернатант отбирали и вносили 100 мкл1-Х аннексин-связывающего буфера комнатной температуры.

Клетки подсчитывали в камереГоряева, после чего готовили образцы, содержащие 0,1*106 клеток в 100 мкл 1-Х аннексинсвязывающего буфера. К 100 мкл клеточной суспензии вносили 5 мкл Alexa Fluor 488 меченыйаннексин V и 1 мкл рабочего раствора йодистого пропидия. Клетки инкубировали прикомнатной температуре 15 минут, после чего вносили 400 мкл 1-Х аннексин-связывающегобуфера и помещали образцы на лед. Анализ образцов проводили на клеточном сортере(Beckman MoFlo XDP, США), используемом в качестве проточного цитометра.Предварительно проводилась настройка лазеров и оптических систем клеточного сортера(Beckman MoFlo XDP, США).

Синий лазер (длина волны 488 нм) и соответствующиесветофильтры настраивали с помощью калибровочных частиц (Beckman Flow-CheckFluorospheres, США). Для оценки флуоресценции Alexa Fluor 488 использовали канал FL-1 сдиапазоном пропускаемых длин волн 515-543 нм. Для оценки флуоресценции йодистогопропидия использовали канал FL-4 с диапазоном длин волн 655-685 нм.

Использовать каналFL-3 с диапазоном пропускаемых длин волн 606-635 нм не стали, так как интенсивностьфлуоресценции в каналах FL-3 и FL-4 была сопоставимой, но в канал FL-4 в отличие от каналаFL-3 не попадала флуоресценция от Alexa Fluor 488.Предварительно по отрицательному контролю, которым служили неокрашенные клетки, вточечной диаграмме выставляли границы. После этого проводили анализ экспериментальныхобразцов с подсчетом количества погибших клеток (PI+, Alexa Fluor 488 меченый аннексин V+) и клеток в состоянии апоптоза (PI–, Alexa Fluor 488 меченый аннексин V +) (рис. 6).53Рисунок 6. Точечные диаграммы, позволяющие определять процент погибшихклеток и клеток в состоянии апоптоза. (а) – отрицательный контроль без добавлениякрасителей, (б) – клетки, культивируемые с добавлением 10 мкМ циклопамина иокрашенные при помощи набора Alexa Fluor 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit.Данные представлены для клеток культуры астроцитов человека.2.8 Определение процента клеток боковой популяцииОценка процента клеток, составляющих боковую популяцию, сначала проводилась наклетках, культивируемых при обычных условиях.

После этого в течение 2-х суток клеткикультивировали в присутствии 5 и 10 мкМ циклопамина с концентрацией DMSO 0,2%. Вконтроле клетки культивировали в ростовой среде с 0,2% DMSO.Работа выполнялась в соответствии с протоколом, предложенным разработчиками метода[256-260]. После снятия клеток их дважды отмывали в растворе HBSS+ (HBSS (Gibco, США),2% FBS, 2 mM HEPES (Gibco, США)). Клетки ресуспендировали в DMEM+ (среда DMEM длякультур клеток без фенолового красного, с 2% ЭБС, 2mM HEPES).

Для каждой пробы (клетки с5 и 10 мкМ циклопамина и контрольные клетки) готовили 5-6 образцов по 500 мкл с 1*106клеток/мл. В два образца добавляли верапамил до конечной концентрации 50 мкМ (SigmaAldrich, США). Все образцы помещали на водяную баню с температурой 37 С°. Через 15 минутво все образцы добавляли краситель DCV до конечной концентрации 5 мкМ (0,5 мкл красителяVybrant® DyeCycle™ Violet Stain, Invitrogen, США на 500 мкл образца) и оставляли образцы на54водяной бане в темноте на 90 минут. Для предотвращения оседания клеток на дно пробирок, ихрегулярно перемешивали при помощи пипетки на 200 мкл.Во время заключительного этапа подготовки образцов проводилась настройка лазеров иоптических систем клеточного сортера, использовавшегося в качестве проточного цитометра(Beckman MoFlo XDP, США). Синий лазер (длина волны 488 нм) и светофильтры,регистрирующее прямое и боковое светорассеяние настраивали с помощью калибровочныхчастиц(BeckmanFlow-CheckFluorospheres,США).Фиолетовыйлазер(405 нм)ссоответствующими фильтрами настраивали по другим калибровочным частицам (BeckmanFlow-Check Pro Fluorospheres, США).По окончании инкубации образцы помещались на лед; в пробирки добавлялся DMEM+(4°С) до 2 мл.