Диссертация (Влияние компонентов сигнального пути HEDGEHOG на пролиферацию и химиорезистентность низкодифференцированных глиом), страница 8

В то же время нацисплатин-резистентных клетках яичников человека было показано, что ингибирование GLI1при помощи трансфекции малых РНК, образующих шпильки (shRNA), приводит к уменьшениюэкспрессии генов ERCC1 и XPD, белки которых принимают участие в данном типе репарации[180]. Но в этом случае влияние GLI1 является опосредованным через связывание GLI1 cпромоторной областью гена другого транскрипционного фактора c-JUN [180, 181]. По одной изверсий в клетках рака яичников за связывание с промоторной областью c-JUN ответственен несам GLI1, а его изоформа C’ΔGLI1 массой 130 кДа, которая не встречается в нормальныхклетках яичников.

В клетках, резистентных к цисплатину, количество C’ΔGLI1 было больше,чем в других вариантах клеточных линий рака яичников [15].Прямая репарация осуществляется при участии фермента MGMT (O6-Метилгуанин-ДНКметилтраснфераза), удаляющего алкильные группы с гуанина в О6 положении и тимина в О4положении [176]. Метилирующий эффект на гуанин в О6 положении оказывает темозоломид[182, 183]. Было обнаружено, что транскрипционный фактор GLI1 способен влиять наэкспрессию MGMT в глиомах, взаимодействуя с GLI1-связывающим сайтом в его промоторнойобласти [95, 184].В репарации вырезанием оснований принимает участие множество ферментов. Какминимум шесть ДНК-гликозилаз обнаруживают и удаляют видоизмененные основания ДНК.После этого апуриновая- или апиримидиновая-эндонуклеаза совместно с фосфодиэстеразойвырезаетсахарофосфат,аДНК-полимеразасовместносДНК-лигазойзаделываютобразовавшуюся брешь [185].

На культуре клеток рака толстой кишки HT29 и на цисплатинрезистентных клетках яичников человека было показано, что ингибирование GLI1 приводило куменьшению экспрессии генов, ответственных за репарацию вырезанием оснований (FEN1,UNG, LIG1, KIAA0101, XRCC1) [178, 180].Наиболее серьезными повреждениями ДНК является разрыв обеих цепей двойнойспирали в результате действия ионизирующего излучения, ошибок репликации, окислителей ипродуктов метаболизма [185].

В клетках млекопитающих существует два механизма репарациидвухцепочечныхразрывов:негомологичногосоединенияконцовигомологичнаярекомбинационная репарация [176]. В клетках человека преобладающим механизмом является34негомологичное соединение концов, а гомологичная рекомбинационная репарация запускаетсяво время репликации ДНК. При негомологичном соединении концы сводятся лигированиемДНК, что сопровождается потерей нескольких нуклеотидов в месте соединения. Эти потери вбольшинстве своем не являются критическими в силу того, что белки кодирует лишь малаядоля генома [176, 185].

Гомологичная рекомбинационная репарация новореплицированнойДНК является более точной, так как в качестве матрицы используется сестринская хроматида[176, 185].В репарации двухцепочечных разрывов принимает участие множество белков, какуникальных, так и задействованных в других типах репарации поврежденной ДНК. Множествоисследований демонстрирует, что ингибирование НН сигналинга на разных уровнях влияет нарепарацию двухцепочечных разрывов по обоим типам. Так использование GANT61 понижаетэкспрессию гена FEN1 (принимает участие в негомологичном соединении концов) [186] и геновRAD51, RAD51C, RAD54B, RAD54L (гомологичная рекомбинационная репарация) в клеткахрака толстой кишки [178, 187]. А в клеточных линиях рака поджелудочной железы циклопаминснижает экспрессию генов, кодирующих белки Ku70, p-ATM и каталитическую субъединицуДНК-зависимой протеинкиназы, устраняющие двухцепочечных разрывы после действияионизирующего излучения [188].

Кроме того, циклопамин увеличивает радиочувствительностьклеточных линий рака поджелудочной железы через ингибирование EGFR-зависимого пути[188].Пациенты с синдромом Горлина имеют герминальную мутацию в гене PTCH1, чтоприводит к активации HH-пути и предрасположенности к спонтанным новообразованиям. Утаких пациентов риск развития онкологического заболевания связан с воздействиемультрафиолетового и ионизирующего излучения, что также указывает на роль сигнального путиHН в ингибировании механизмов репарации поврежденной ДНК [176]. В эксперименте на Ptc+/–мышахотмечалосьповышениеэкспрессииGLI1снакоплениеминдуцированныхионизирующим излучением хромосомных аберраций [189].Влияние сигнального пути Hedgehog на процессы апоптоза в опухолевых клеткахНесмотря на то, что НН сигналинг и иные механизмы в опухолевых клетках стимулируютпроцессы репарации поврежденной ДНК, мутации в клетках с течением времени все равномогут накапливаться.

К факторам, влияющим на накопление неустраненных мутаций можноотнести химическое строение терапевтического препарата (повреждения одними веществамимогут устраняться с меньшей эффективностью, чем повреждения другими веществами, а35некоторые повреждения не подлежат устранению), концентрация химиотерапевтическогопрепарата (при высоких концентрациях химиотерапевтического препарата клетка может неуспевать устранять все повреждения ДНК) и активность репарационных систем, что в своюочередь зависит от влияния множества факторов.

Аналогичные рассуждения справедливы и дляионизирующего излучения – тип излучения и доза излучения влияют на динамику накоплениямутаций.Накопленные мутации через запуск механизмов апоптоза должны приводить к клеточнойгибели. В случае если гибель не наступает, такие клетки с мутациями продолжаютнеконтролируемо делиться, что вносит свою роль в течение онкологического заболевания, егопрогрессию, метастазирование и отсутствие ответа на дальнейшую терапию [176, 190].Существуют работы, демонстрирующие влияние сигнального пути НН на процессы апоптоза вопухолевых клеткахАпоптоз запускается за счет внутренних и внешних механизмов, которые в конечномитоге влияют на активацию каспазы 3, приводящей к деградации ДНК и образованиюапоптотическихтелец.АпоптозрегулируетсяпосредствомсемействаBcl-2белков,регулирующих проапоптотические и антиапоптотические факторы [190].

В исследованиях поингибированиюSMOиGLI1(ингибированиеосуществлялосьприпомощималыхинтерферирующих РНК, висмодегиба и IPI-926) при раке поджелудочной железы наблюдалосьповышение апоптоза путем регулирования каспазы 3 [137, 174, 191]. При помощи малыхинтерферирующих РНК к мРНК GLI1 отмечалось увеличение апоптоза в клетках карциномымолочной железы [133]. При раке яичников обнаружена связь между функционированием ННсигналинга и уровнем Bcl-2, являющегося антиапоптотическим регулятором, и показано, чтоингибирование НН сигналинга циклопамином вызывало апоптоз [142, 192]. Ингибирование ННсигналинга циклопамином при глиомах приводило к увеличению апоптоза [91, 193].

Вкератиноцитах при базальноклеточной карциноме было показано, что GLI1 являетсятранскрипционным фактором для гена Bcl-2 и повышает его экспрессию, в то время как GLI3ингибирует экспрессию Bcl-2 через инактивацию GLI1 [194].Влияние сигнального пути Hedgehog на химиорезистентность, обусловленную изменениемаккумуляции и метаболизмом химиотерапевтических препаратовABC белки, получившие свое название благодаря наличию высокогомологичных АТФсвязывающих доменов, составляют белковое суперсемейство и присутствуют у всех живыхорганизмов [195].

Одной из функций ABC переносчиков является предотвращение накопления36экзогенных препаратов в клетках. В опухолевых клетках повышенное количество ABCпереносчиковспособствуетмультилекарственнойрезистентностикдоксорубицину,темозоломиду, цисплатину, этопозиду, винкристину, метотрексату, эпирубицину, колхицину,паклитакселу идругимхимиопрепаратам[195-197].Запредотвращениенакоплениядоксорубицина, темозоломида и цисплатина в клетках в большей степени ответственны ABCB1(P-гликопротеин), ABCC1 и ABCC2 переносчики [196, 197].Эти переносчики в своей структуре имеют субстрат-связывающие сайты, с которымивзаимодействуют экзогенные препараты после проникновения в клеточную мембрану [198].Таким образом, ABC переносчики не выкачивают препараты из клеток, а предотвращают ихпроникновение из клеточной мембраны в цитоплазму.Громоздкие амфифильные соединения за счет гидрофобной части быстро проникают вклеточную мембрану, в то время как гидрофильная часть препятствует быстромупроникновению в цитоплазму.

Необходимого для этого времени оказывается достаточным длявзаимодействия вещества с субстрат-связывающим сайтом ABC переносчика, после чегоосуществляется транспортировка вещества из клеточной мембраны в окружающую среду.Механизм взаимодействия ингибиторов с ABC переносчиками обусловлен их эффективнымконкурированием с химиопрепаратами за транспорт и благоприятными биофизическимисвойствами.

В присутствии большого количества ингибитора, активно взаимодействующего ссубстрат-связывающим сайтом, ABC переносчики будут не успевать выкачивать громоздкиехимиопрепараты и времени оказывается достаточно для проникновения части молекулхимиопрепарат внутрь клетки [195, 199, 200]. Было продемонстрировано, что ABC переносчикиэффективно выкачивает только те соединения, которые медленно проникают через мембрану, вто время как активно проникающие соединения полностью выкачивать не удается [200, 201].Было показано, что GLI1 оказывает влияние на мультилекарственную резистентность,повышая экспрессию генов суперсемейства ABC: MDR1 (он же ABCB1) и BCRP (он же ABCG2),белки которых активно выводят химиотерапевтические препараты из клетки [202].

Нахимиорезистентной культуре клеток лейкемии было показано, что ингибирование сигнальногопути способствует снижению экспрессии ABCB1 [203]. Аналогичные данные о влиянии ННсигнального пути на мультилекарственную резистентность, опосредованную повышениемэкспрессии ABCG2, получены в клетках B-клеточной лимфомы [204]. А ингибированиеактивности GLI1 приводило к снижению ABCG2 в клетках B-клеточной лимфомы итуморосферах рака поджелудочной железы [204, 205].

Влияние на Р-гликопротеин и ABCG2НН сигналинг оказывает также в эпителиальных клетках рака яичников и простаты [206, 207].А комбинированное применение ингибитора HH сигналинга висмодегиба и доцетаксела37значительно увеличивало ответ на терапию, в сравнении с контролем, где клеткикультивировали только в присутствии доцетаксела [208].Помимо того, что НН сигналинг способен активировать процессы репарации ДНК,поврежденнойцисплатиномидругимиплатиносодержащимихимиотерапевтическимипрепаратами, GLI1 также способен влиять на транспортеры накапливающие (OCT1/2/3, CTR1)платиносодержащие вещества в клетках и способствующие выведению (ATP7B) их из клеток.А ингибирование GLI1 приводит к накоплению цисплатина в ядре клетки.