Диссертация (Влияние компонентов сигнального пути HEDGEHOG на пролиферацию и химиорезистентность низкодифференцированных глиом), страница 10

checkpoints)проверяется на наличие химического или физического стресса или повреждения ДНК. Пока этинарушения не будут устранены, клетка не способна приступить к репликации и делению. Вслучае невозможности устранения нарушений клетка подвергается апоптозу. Несмотря на то,что опухолевые клетки дефектны по своей природе и функциям, они стараются обойтиконтрольные точки, используя для этого различные сигнальные пути, в том числе и ННсигналинг [128, 240].На клетках рака толстой кишки было продемонстрировано, что ингибирование GLI1 припомощи GANT61 или малых интерферирующих РНК приводило к аресту клеточного цикла вG1/S, ранней S фазе и G2/M контрольных точках.

При этом наблюдалось понижениеэкспрессии генов, способствующих прохождению контрольных точек: E2F2, гена циклина Е2,Cdc25a, Cdk2, для G1/S контрольной точки и генов циклина A2 и циклина B2, Cdc25c, Cdc20,Cdc2 для G2/M контрольной точки [186, 187].Мутации в PTCH1 при базально-клеточной карциноме ассоциированы с аномальнымвходом клеток в клеточный цикл, аномальным синтезом циклинов D типа (белки,регулирующие клеточный цикл), сниженной экспрессией p53 и повреждением ДНК.

Такжебыло показано, что мутации в SUFU могут приводить к блоку в G2/M фазе клеточного цикла,что может свидетельствовать о роли SUFU в преодолении G2/M контрольной точки [241].Было показано, что GLI1 через регуляцию (ATR)/Chk1 сигналинга способен ингибироватьпроцессы репликативного стресса и влиять на преодоление контрольной точки S-фазыклеточного цикла и резистентности к химиотерапии, что способствует увеличению геномнойнестабильность в клетках опухоли. А применение ингибиторов НН сигналинга повышаетчувствительность клеток рака легкого, прямойкишки и яичников к ингибиторамТопоизомеразы 1 (например, кампотецин, иринотекан и топотекан), что может рассматриватьсякак эффективная терапевтическая тактика при лечении этих онкологических заболеваний [242].42Гиперэкспрессия GLI2-β в человеческих кератиноцитах приводила к появлению хромосомныханомалий, таких как хромосомные транслокации, анеуплоидия и тетраплоидия, а такжеприводила к уклонению клеток от апоптоза и преодолению контрольных точек клеточногоцикла [243].Уклонение от подавления ростаОдним из механизмов опухолевых клеток, позволяющих им уклоняться от подавленияроста является способность регулировать процессы аутофагии.

Аутофагия запускается врезультате клеточного стресса или действий инфекционных агентов. В процессе аутофагиинаблюдается секвестрация клеточных элементов, их транспорт в лизосомы, деградация ипоследующая утилизация продуктов деградации [244].Было показано, что НН сигналинг способен ингибировать процессы аутофагии приразных патологических процессах, в том числе и онкологических.

А микобактерии, шигеллы илистерии способны ингибировать аутофагию путем активации сигнального пути HH черезактивацию mTOR [245]. Ингибирование SMO и GLI1 при немелкоклеточном раке легкогостимулировало процессы аутофагии и апоптоза [246]. В экспериментах на клеточных линияхпротоковой аденокарциномы поджелудочной железы использование GANT-61 приводило каутофагии клеток [247]. Аналогичный ответ на GANT-61 наблюдался и в клеточных линияхгепатоцеллюлярной карциномы [248]. Также есть данные об ингибировании аутофагии ННсигналингом при хондросаркоме [249].

Таким образом, уклонение клеток от аутофагии являетсяодним из путей дальнейшего прогрессирования опухолевого процесса.Теломеразная активностьДля опухолевых клеток характерна неограниченная способность репликации ДНК, чтодостигается путем повышения теломеразной активности. На клетках рака прямой кишки,простаты и глиобластомы было показано, что НН сигналинг регулирует теломеразнуюобратную транскриптазу, которая в комплексе с теломеразной РНК и двумя молекуламидискерина принимает участие в удлинении теломер [250, 251]. Ингибирование GLI1 припомощиGANT-61приводилокснижениютеломеразнойактивности[251].Примедуллобластоме были обнаружены мутации в промоторе TERT, повышающие теломеразнуюактивность [252].43Глава 2. Материалы и методы2.1 Реактивы, расходные материалы, клеточные линии и их культивированиеРабота с культурами клеток проводилась в ламинаре Esco SC2 Class II BSCc (Esco,Сингапур) в стерильных хирургических перчатках (SFM, Германия).

Перед работой в ламинарена 1 час включали ультрафиолетовую лампу. Ежедневно на ночь в культуральной комнатеавтоматически включались 3 ультрафиолетовые лампы.Клетки выращивали на ростовых средах DMEM, DMEM/F-12 (Gibco, США) сдобавлением GlutaMAX (Gibco, США) или L-глутамина (Gibco, США), раствора антибиотиковантимикотиков (пенициллин, стрептомицин) (Gibco, США) и ЭБС (Biovest, Франция).Среды и растворы готовили в стерильных полипропиленовых пробирках 50 мл и 15 мл(Corning, США).

Приготовление растворов осуществлялось с помощью дозаторов (HTL SWIFTPET+, Польша) и стерильных серологических пипеток на 2, 5, 10 мл (Cellstar, США). Длявнесения различных веществ использовали механические пипетки с переменным объемом (HTLDiscovery Comfort, Польша) и наконечники на 1000, 200 и 10 мкл (Omnitip, США).Используемый стерильный пластик был одноразовым. Нестерильный пластик перед работойавтоклавировался (Sanyo MLS3781L, Япония).Клетки глиобластомы человека линии U-87 MG получены из Американского Банкаклеточных культур (ATCC® Number: HTB-14™). Культура клеток глиобластомы человека U251 MGбылалюбезнопредоставленаА.С.

Халанским,руководителемлабораторииэкспериментальной гистопатологии центральной нервной системы Научно-исследовательскогоинститута морфологии человека, Москва. Культура астроцитов человека была получена вотделе фундаментальной и прикладной нейробиологии “Национального медицинскогоисследовательского центра психиатрии и наркологии имени В.П.

Сербского”. Клеткизаморожены на втором пассаже и хранятся в жидком азоте в клеточном банке лаборатории.Клетки глиобластомы человека линии U-87 MG культивировали в среде DMEM c низкимсодержанием глюкозы, с добавлением 10% ЭБС, 2 мМ GlutaMAX, 100 ед/мл пеницилина, 100мкг/мл стрептомицина. Клетки глиобластомы человека линии U-251 MG культивировали всреде DMEM с 4,5 г/л глюкозы, 10% ЭБС, 4 мМ L-глютамина, 100 ед/мл пеницилина, 100мкг/мл стрептомицина. Астроциты человека культивировали в среде DMEM/F-12 с 10% ЭБС,пенициллином (100 ед/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл).44Клетки росли в культуральных флаконах 25 см2 (Corning, США) при 37˚С во влажнойатмосфере с 5% СО2 в СО2 инкубаторе (Sanyo, Япония).

Состояние культур и рост клетокконтролировали с помощью микроскопии на инвертированном микроскопе Leica DMI 3000B(Leica, Германия).При образовании монослоя культуры пассировали с коэффициентом рассева 1:3-1:10 ибрали в эксперименты. При пассажах клеток ростовую среду удаляли, монослой промывалиDPBS (Gibco, США). Для снятия клеток с пластика и получения суспензии клеток использовали0,25% или 0,125% раствор Tripsyn-EDTA (Gibco, США). К полученной суспензии клетокдобавляли питательную среду и переносили в 2,0 или 1,7 мл пробирки (SSI, США). Клеткиосаждали при 400g (Eppendorf centrifuge 5810R, Германия), отбирали супернатант и осадокклеток суспендировали в 1 мл ростовой среды. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.2.2 Препараты ингибирования и активации сигнального пути НedgehogВ качестве ингибитора НН сигналинга использовали циклопамин (LC Lаbоrаtoriеs, США),разведенный в DMSО (Sigma-Aldrich, США) до концентрации 5 мМ.

При инкубации с клеткамииспользовали концентрации препарата 5 и 10 мкМ. Концентрация DMSO в культуральнойсреде при этом составляла 0,2%. В части экспериментов с линией U-87 MG концентрацияDMSO в культуральной среде составляла 1,6%. Для получения концентрации препарата 10 мкМк 100 мкл клеточной суспензии добавляли 0,2 мкл 5 мМ раствора циклопамина. Для полученияконечной концентрации препарата 5 мкМ к 100 мкл клеточной суспензии добавляли 0,1 мкл5 мМ раствора циклопамина и 0,1 мкл растворителя (DMSO).В качестве активатора сигнального пути применяли рекомбинантный человеческий Nконцевой полипептид Shh (PeprоTech, США).

Лиофилизат препарата разводили доконцентрации 100 мкг/мл в среде DMEM с низким содержанием глюкозы, содержавшей 1%ЭБС.2.3 Химиотерапевтические препаратыВ качестве химиотерапевтических препаратов применяли цисплатин (Sigma-Aldrich,США) и доксорубицин (LC Laboratories, США), разведенные в воде (8 мМ и 16 мМ,45соответственно), и темозоломид (Sigma-Aldrich, США), разведенный в среде DMEM с низкимсодержанием глюкозы (16 мМ).2.4 Выделение суммарной РНК и синтез кДНККлетки линий U-87 MG, U-251 MG и культуры астроцитов человека снимали с пластика,отмывали 2 раза DPBS (Gibco, США) и удаляли супернатант.

К оставшейся массе клетокдобавляли 700 мкл QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, Германия), охлаждали на льду, добавляли 140мкл хлороформа (Химмед, Россия) и центрифугировали 15 минут со скоростью 12000 оборотовв минуту при температуре 4 ˚С. 350 мкл верхней фазы отбирали при помощи пипетки на 1000мкл, переносили в пробирку на 2 мл и добавляли 525 мкл 95% спирта. Пробирки помещали вавтоматическую станцию для выделения нуклеиновых кислот и белков QIAcube (Qiagen,Германия).

Далее на приборе при помощи одноразовых хромотографических silica spinколонок, RWT и RPE буферов и деионизированной воды выделяли суммарную РНК. 20 мклотбирали для последующего анализа, а оставшуюся часть пробы помещали в кельвинатор(Sanyo, Япония) на -80 ˚С [253].На спектрофотометре NanoVue Plus (GE, Великобритания) оценивали степень очисткиРНК при помощи параметров A260/A280 и A260/A230, где A260, A280 и А230 – этопоглощение света соответствующей длины волны.