Диссертация (Популяционная структура адвентивного вида Helix pomatia L. в условиях юго-восточной части ареала), страница 14

д.50°13'22.46"c.ш.38°00'34.51" в. д.55°38'11.43"c.ш.38°06'02.81" в. д.261550°08'12.677" с.ш.,14°47'38.217" в.д.2049°15'41.59" с.ш.,21°41'39.41" в.д.2051°08'47.40" с.ш.,16°57'36.72" в.д.2070Рис. 3.2. Схема промеров раковины H. рomatia(экземпляр из пункта «Яблоново»)Для анализа использовали только раковины, окончившие рост иобразовавшие отворот на устье. Схема промеров приведена на рисунке 3.2.Обработкулинейныхконхиологическихпараметровраковиныпроводили при помощи MsOffice Exel. При сопоставлении выборокиспользовали критерий Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ(ANOVA) (Плохинский, 1970). Нормальность распределения проверяли припомощи критерия хи-квадрат в программе Statistica 6 (модуль «DistributionFitting» – «Подгонка распределений»).713.2.

Фенетический анализ раковин H. рomatia.Оценка характера опоясанности раковин пигментными лентами вкомплексе с анализом других параметров (морфологических, генетических)может добавить информативности исследованию, поскольку фенетическийподход важен при оценке популяционной изменчивости видов.В нашем случае у виноградной улитки, как и у многих видовраковинных моллюсков (наиболее известный пример – улитки рода Cepaea),а также некоторых других видов рода Helix (например, H. аlbescens), имеетсявыраженный полиморфный характер окраски раковины. Принято выделятьна раковине 5 продольных пигментированных полос. Обычным являетсявариант, когда ленты сливаются между собой.

Обозначения фенотипов былиприняты в соответствии с методикой (Cain A.J., Sheppard P.M., 1950),успешно применяемой к видам рода Helix (Крамаренко С.С., КрамаренкоА.С., 2009; Снегин Э. А. и др., 2014). Ленты нумеровали от 1 до 5, приориентации раковины вершиной вверх. Нумерацию начинали от полосыближайшей к шву между завитками к пупку раковины (Рис. 3.3. и Рис. 3.4.).Если полоса отсутствовала, то ставили цифру 0. Номера слившихся полосзаключали в скобки.В ходе исследований мы оценили частоту каждой морфы в популяции,вычислили среднее число морф (µ), частоту редких морф (h), а такжерассчитали показатель сходства популяций по фенетическим признакам (r)(Животовский, 1979, 1991):mr   pi qii 1  ( q1  q2  ...

 qm ) 2 , S m   (m   ) / Nh  1  (  / m) , S h  h (1  h ) / Nгде p и q-частота i-морфы в сравниваемых популяциях, Sm Sh ошибкисоответствующих показателей µ и h; q1, q2, qm- частоты соответствующихморф (m), N - объем выборки.72Рис. 3.3. Пример наиболее часто встречающихся фенотипических морф:1(23)45 и 12345. (Полоса 5 не видна по причине ракурса раковин)Рис.

3.4. Пример фенотипа 1(234)5 с разных ракурсовПосле описания фенотипов раковин, данные по ним переводили вбинарную матрицу, где наличие полосы обозначали как 1, а её отсутствие 73как 0. Варианты слившихся полос также обозначали как отдельный фенцифрой 1 (например, фенотип 1(234)5 обозначали как 100011, а фенотип12345 – как 111110).Всего было проанализировано 546 экземпляров из 12 популяций, срединих отмечено 7 вариантов цветовых морф.3.3.

Электрофорез ферментов H. рomatia в полиакриамидном геле(ПААГ)При помощи камеры VE-20 (Helicon, Россия) проводили электрофорезввертикальныхобщепринятойпластинахметодикеполиакриламидного(Остерман,1981).геляДанную(ПААГ)поразновидностьэлектрофореза впервые в 1959 году применили S. Raymond and L. Weintraub.Теоретические основы метода заложили Ornstein L. и Davis B. в 1964 году.Для того, что бы избежать гибели животных, от ноги каждойисследуемой особи отщипывали небольшой кусочек массой около 20 мг.Полученнуютканьгомогенизировалив40%растворесахарозысдобавлением бромфенолового синего.Электрофорез проводили в 10%-ном полиакриламидном разделяющемгеле.

Для инициации полимеризации использовали сочетание катализаторовперсульфатааммонияитетраметилэтилендиамин.Верхнийконцентрирующий гель полимеризовался в процессе фотохимическойреакции с участием рибофлавина. Для эксперимента готовили электродныйTrisxGlycine буфер рН=8,3 (составы растворов указаны в таблицах 3.2., 3.3.).В лунки концентрирующего геля вносили 15 мкл гомогената.Продолжительность электрофореза составляла 3,5-4 часа при напряжении200В и температуре среды около +4 ͦ С. Окрашивание на выявление эстеразпроводили после инкубации гелевой пластины в растворе 3% борнойкислоты.

Гель выдерживали в растворе TrisxHCl буфера (рН=7,4) вприсутствии α-нафтилацетата и красителя прочного красного (Fast Red). Длявыявления NAD-зависимой малатдегидрогеназы гель выдерживали 1-2 часа в74темноте в растворе TrisxHCl буфера (рН=8,4) с присутствием связывающегоисследуемыйсубстратнитросинего,катализатораОкрашиваниегелевыхNAD(дифосфопиридиннуклеотид),феназинметасульфатапластиннавыявлениеитетразолямалатанатрия.супероксиддисмутазыпроизводили путем последовательного чередования воздействия световыхлучей и инкубацией в темноте в растворе калий-фосфатного буфера (рН=7,8),тетразоля нитросинего, феназинметасульфата и MgCl2 (табл.

3.4.).Таблица 3.2.Состав растворов для электрофореза изоферментовРастворАрН = 8,9Составляющие компонентыКоличество веществаHCl (1 н раствор)48 мл36,6 г0,23 млдо 100 мл48 мл5,98 г0,46 млдо 100 мл28 г0,735 гдо 100 мл10 г2,5 гдо 100 мл4 мгдо 10 мл40 мгдо 100 мл0,140 гдо 100 мл6г28,8 гдо 1 лTrisТетраметилэтилендиаминН2ОHCl (1 н раствор)ВрН = 6,7СDЕFПФЭлектродный буферрН = 8,3TrisТемедН2 ОАкриламидБисакриламидН2 ОАкриламидБисакриламидН2 ОРибофлавинН2 ОСахарозаВодаПерсульфат аммонияН2 О аTrisGlycineН2 О75Таблица 3.3.Состав растворов для приготовления гелей различных концентрацийКонцерация(%)Растворы (мл)А88887,58,09,010,0В5Разрешающий гельС161820,222,5Концентрирующий гельD15Н2 О8ПФ32323232E5F15Таблица 3.4.Компоненты для ферментативных реакцийИсследуемый ферментЭстеразыESTСупероксиддисмутазаSODМалатдегидрогеназаMDHСоставляющие компонентыα-нафтилацетатПрочный красный Fast Red TR0,1 М TrisxHCl буфер (рН 7,8)тетразоль нитросинийфеназинметасульфатMgCl20,1М калий-фосфатный буферрН=7,8тетразоль нитросинийфеназинметасульфатдифосфопиридиннуклеотидМалат натрия0,1М TrisxHCl буфер (pH=8,4)Навеска в-ва, г10 мг3 мг100мл15 мг15 мг20 мг100 мл15 мг15 мг15 мг40 мг100 млУ H.

pomatia по исследуемым ферментам были выявлены четырелокуса (рис. 3.5., 3.6.): два локуса мономерных эстераз (EST3 и EST4 с тремяаллелями каждый), димерный локус супероксиддисмутзы с двумя аллелями(SOD 1) и димерный локус малатдегидрогеназы с двумя аллелями (MDH 1)(Снегин, 2012).76Границы исследуемых локусов определяли путем сопоставлениянаблюдаемых частот аллелей и ожидаемых частот аллелей по закону ХардиВайнберга с помощью критерия χ2.Рис.3.5. Схематическое изображение выявленных локусовSOD, MDH, EST-3 и EST-43.4. Методика проведения полимеразной цепной реакции3.4.1. Выделение ДНКВыделение ДНК осуществляли из ноги моллюсков по стандартнойметодике(Sambrocketal.1989;Сиволап,1998)сизменениями,адаптированными для моллюсков (Снегин, 2012).

Навеску ткани (100 мг)заливали 500 мкл лизирующего буфера (10мМ TrisxHCl pH 8,0, 100мМ NaCl,2мМ EDTA pH 8,0, SDS 1%, протеиназа К 0,1 мг/мл) с добавлением 2меркаптоэтанол (20 мМ), который путем разрыва дисульфидных связей вбелковых молекулах дополнительно разрыхлял и разжижал вязкую слизь.Лизис в пробах проходил в течение 12 часов при температуре около +37◦С(либо 2 часа при температуре +55◦С). Далее добавляли 500 мг смесихлороформ-изопентанол (24:1), на вортексе взбалтывали пробирку дообразования эмульсии.

Центрифугировали в течение 4 минут при 14000об./мин. Верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку эппендорф идобавляли 600 мкл 2-пропанола, и перемешивали на вортексе. Полученнуюсмесь центрифугировали для осаждения ДНК 4 минуты при 14000 об./мин.Надосадочную жидкость отбирали, а к осадку прибавляли 100 мкл 1,2МраствораNaClиполностьюрастворяливнемосадок.77SOD 2EST3EST4MDH 1Рис. 3.6. Электрофореграммы изоферментов H.pomatia78Прибавляли 300 мкл охлажденного этанола, снова перемешивали,выдерживали пробы при t=-20◦С 10 минут для выпадения осадка ДНК, азатем центрифугировали 3-4 минуты при 10000 об./мин.

Отбирали этанол, незадевая осадка (последнюю операцию повторяли 2-3 раза). Этанол отбирали,осадок высушивали в термостате при температуре около 37◦С, добиваясьполного испарения спирта, но избегая пересушивания образцов ДНК.Избавленный от этанола осадок растворяли в 100 мкл буфера ТЕ сдобавлением рибонуклеазы из расчёта 1 мкг РНКазы на 1 мл буфера ТЕ.Полученные образцы хранили при температуре -20◦С не более 2 месяцев.3.4.2.

Межмикросателлитный анализ ДНКИзменчивость ДНК анализировали при помощи метода ISSR-PCR (InterSimple Sequence Repeats- метод полимеразной цепной реакции) (Zietkiewiczet al., 1994).Перед проведением амплификации пробы подготавливали следующимобразом: из расчета на одну пробирку брали 5 мкл готовой смеси для ПЦРScreenMix-HS (Евроген), содержащей буфер (67 мМ TrisxHCl (рН 8,8), 16 мМ(NH4)2SO4, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 7 мМ EDTA, 3 мМ MgCl2), 0,25 мМdNTP, 1 единица Taq-ДНК-полимеразы, ингибированной для горячего старта.К смеси добавляли праймер в объеме 0,05 мкл (0,5 мкМ), 2 мкл матрицыДНК и 12,95 мкл деионизированной воды.Для амплификации использовали три праймера, разработанные вУниверситетеБританскойКолумбии(комплект№9,www.michaelsmith.ubc.ca):UBS-809 (5‫׳‬-AGAGAGAGAGAGAGAGG-3‫)׳‬,UBS-811 (5‫׳‬-GAGAGAGAGAGAGAGAC-3‫)׳‬,UBS-827 (5‫׳‬-ACACACACACACACACG-3‫)׳‬Амплификация проходила в термоциклерах MJ Mini и MyCycler(BioRad, США).

Схема реакции следующая: «горячий старт» - 2 мин приt94°С, 40 циклов (денатурация - 30 с при t94°С, отжиг праймера- 30 с при7955t°С, синтез - 2 мин при t72 °С), дополнительный синтез 10 мин при t72°С,охлаждение до t4°С (Снегин, 2013). Величина необходимой температурыотжига (T°) подбиралась индивидуально для каждого праймера, так какизвестно,чтодляISSR-праймеровтемператураотжигавлияетнаколичественный и качественный состав спектров продуктов ПЦР. Известно,что при росте T до определенной величины, происходит рост интенсивностиодних ампликонов и/или ослабление других (Гришин, Заякин, 2012). Дляпраймера UBS-827 T=55°С, для UBS-809 T=52°С, UBS-811 T=50°С.Образцы после амплификации вносили в лунки 1%-ного агарозногогеля в горизонтальной камере с ТАЕ-буфером, также в ряду лунок собразцами использовали маркер молекулярной массы ДНК M-Combi (Isogen),размерность фрагментов которого составляла 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350,400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000 п.н.