Диссертация (Экспериментальное обоснование возможности применения 68Ga - цитрата для визуализации воспалительных процессов методом позитронно-эмиссионной томографии), страница 12

Сопоставление клиниколабораторных данных с полученными изображениями патологии помогает67повысить правильную интерпретацию результатов визуализации, а такжеоблегчает понимание течения патологического процесса и снижает рисквозникновения осложнений в результате ошибочного диагноза или запоздалойдиагностики с последующим лечением.Анализдиагностикисостоянияи,впроблемычастности,эффективностинеинвазивнойрадионуклиднойвизуализацииметодамиэмиссионной томографии в комплексном вопросе лечения воспалительныхпроцессов различной природы и локализации подтверждает необходимостьвнедренияновыхрадиофармпрепаратов,обладающихвысокойспецифичностью накопления в патологическом очаге.Большинство из описанных препаратов так и не получили популярностив клинической практике – по сравнению с традиционно использующимисямечеными лейкоцитами или ФДГ свойства исследуемого 68Ga-цитрата позволятизбежать неудобств, связанных с отсутствием циклотрона в ПЭТ-центрах,рутинных методов приготовления РФП и, главное, больших лучевых нагрузокна пациента и персонал.

Дополнительное введение ФПС цитрата стабильногожелеза(III)благоприятноскажетсянасовершенствованиибыстройвизуализации очагов воспаления в ранние сроки после введения 68Ga-цитрата.Актуальность исследований препарата68Ga-цитрат с его свойствами вкачестве нового диагностического средства обуславливает необходимостьпроведениядальнейшихисследований,направленныхфункциональной пригодности и безопасности примененияна68изучениеGa-цитрата длявизуализации воспалительных процессов методом позитронно-эмиссионнойтомографии.682.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙРабота выполнена на базе кафедры радиобиологии и вирусологииимени академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина при ФГБОУ ВО МГАВМиБ –МВА имени К.И. Скрябина в коллаборации с отделом радиационныхтехнологий медицинского назначения при ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И.Бурназяна в период с 2013 по 2016 гг.2.1. Объекты исследованияОбъектами исследования являлись радиофармацевтические препараты67Ga-цитрат и68Ga-цитрат (Цигалин, ООО «ДИАМЕД») с активностью 37-740 МБк/мл для визуализации смоделированных очагов воспаления уживотных и ФПС трехвалентного железа – цитрат железа (III) в видерастворов для внутривенного введения (Фероцит, ООО «ДИАМЕД») дляблокирования металлсвязывающей способности транспортных белков крови,и, как следствие, быстрого повышения контрастности ПЭТ-изображений.Получениерадионуклидов,атакжехарактеристикаисинтезрадиофармацевтических препаратов описаны в Приложении А настоящейдиссертационной работы (с.

156).2.1.1. Подбор оптимальной концентрации цитрата железа (III)Для выбора концентрации цитрата железа (III), необходимой длямаксимальногоблокированияметаллсвязывающейспособноститрансферрина провели серию экспериментов по изучению эффективностисвязываниятрансферринасрадиоактивнымгаллиемвприсутствиитрехвалентного железа (III) в различных концентрациях in vitro. В серииэкспериментов к раствору трансферрина с различными концентрациямицитрата железа (III) добавляли фиксированную активность элюата галлия68Ga. После инкубирования в течение 5-10 минут долю связывания галлия68Ga с трансферрином от общей активности связанного и свободного галлияопределяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в различныхсистемах с использованием TLC-scanner Mini-Gita (Raytest, Germany).69Растворы цитрата железа (III) готовили путем добавления растворов сразличными концентрациями (10-3 М, 3·10-3 М, 5·10-3 М, 10-2 М и до 10-1 М)хлорида железа (III) в 0,1 М раствор цитрата натрия.2.1.2.

Расчет используемых активностей и доз для исследованийСогласномеждународномуопытуисследованиярадиофармацевтических препаратов в области радионуклидной диагностикиивизуализацииразличныхпатологий,используемыеактивностирадионуклидов зависят от детекторной чувствительности регистрирующегоприбора и зачастую не превышают 400 МБк (100-200 МБк/м2 поверхноститела человека или животного). Для настоящих исследований удельнаярадиоактивность не превышала 37 МБк/мл (1 мКи/мл).Расчет вводимых животным доз, эквивалентных человеческой (ЭД),для оценки безопасности лиофилизатов (по п.

2.4.1-2.4.3) проводили с учетомкоэффициентов пересчета человек/экспериментальное животное (МироновА.Н., 2012): =ℎ ∙ ℎℎ ∙ (1)где Pa – эквивалентная доза для животного, мг/кг; Ph – доза длячеловека по основному веществу (цитрат) на инъекцию; Mh – средняя массачеловека (70 кг); Kh – коэффициент межвидового переноса доз для человека(39,0), Ka – коэффициент межвидового переноса доз для животного (Ккрыса =6,5, масса 200-250 г; Кмышь = 3,0, масса 20-25 г; Кморская свинка = 6,0, вес 250-300г).За предполагаемую однократную дозу введения для человека (70 кг)принимали содержание основного вещества в одном флаконе лиофилизатадля приготовления РФП, установленное в период поисковых исследованийпо его составу: для цитрата натрия – 43,3 мг/флакон (0,62 мг/кг), для цитратажелеза (III) – 9,8 мг/флакон (0,14 мг/кг).702.2.

Экспериментальные животныеМатериалами исследования (биологическими тест-системами) являлись550 крыс и мышей: 140 нелинейных крыс-самок массой 181,9±16,0 г, 60нелинейных мышей-самок массой 20,3±1,7 г, 140 мышей (самок и самцов)линии BALB/c массой 21,4±1,7 г, 210 крыс (самок и самцов) линии SpragueDawley массой 192,1±17,8 г.Животные были получены из питомников лабораторных животных«Филиал Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России и «Пущино» ФИБХРАН, содержались в требуемых условиях при естественном световомрежиме, на стандартной диете, свободном доступе к воде и пище.

Животныебыли включены в эксперименты после 14-ти дневного карантина. Всеманипуляции с животными, связанные с проведением экспериментальныхработ и умерщвлением, проводились в соответствии с принципаминадлежащей лабораторной практики (ГОСТ 33044-2014 от 01.08.2015 г.),методическими рекомендациями и правилами, принятыми Европейскойконвенциейпозащитепозвоночныхживотных,используемыхдляэкспериментальных и иных научных целей (ECPVAU EOSP, 1986).Манипуляциисживотнымипроводилисьподгазовым(смесьизофлурана с кислородом) или хлоралгидратным наркозом (400 мг/кг, в/б).2.2.1. Моделирование асептического воспаления мягких тканейДля получения очага воспаления животным внутримышечно вводилистерильный раствор скипидара (мышам массой 20,7±2,1 г вводили 0,07±0,02мл, крысам массой 181,9±16,0 г – 0,30±0,05 мл). Рекомендуемый объемвводимого раствора скипидара был получен опытным путем анализазависимости введения различного объема ирританта от процента падежаживотных, сроков формирования и степени развития воспаления.

Растворскипидара стерилизовали путем его фильтрования через стерилизующийфильтр (Шишацкая Е. И., 2007).712.2.2. Моделирование септического воспаления легкогоДля моделирования воспаления легкого использовали культуру клетокE. coli. Клетки культивировали в течение 3-4 суток в термостате в среде LB(10 г бактотриптон, 5 г дрожжевой экстракт, 10 г хлорида натрия на 1 лсреды). Микробные тела в количестве 4·106 в объеме 0,10±0,02 мл вводиливнутрилегочно мышам массой 20,3±1,9 г, после чего на третьи суткиразвивалась острая форма воспаления легкого (Groll A.H. et al., 1999).2.2.3.

Моделирование септического остеомиелитаДля получения модели посттравматического остеомиелита у мышеймассой 19,8±1,7 г нарушали целостность бедренной кости путем перелома споследующим введением через отверстие в костномозговой канал культурыклеток S. aureus (штамм 25923, в дозе 3·106 микробных тел) в объеме0,10±0,02 мл, культивированных на МПА. Острая фаза воспаленияформировалась на 5 сутки (O’Reilly T., Mader J.T., 1999).2.2.4. Моделирование заболевания воспаленного кишечникаДля получения синдрома IBD (inflammatory bowel disease) –заболевания воспаленного кишечника (или кишечного колита) мышаммассой 20,6±1,4 г в течение 6 суток, вместо обычной питьевой воды,спаивали 3%-ный раствор декстрана сульфата натрия (DSS, dextran sodiumsulphate) (Bettenworth D. et al., 2013).***Развитие воспалительной реакции у животных оценивали визуально поповеденческим реакциям, также путем пальпации места введения.

Дляподтверждения воспалительного процесса в острой фазе развития проводиликлинический анализ крови с помощью ветеринарного гематологическогоанализатора Exigo 17 (Boule Medical, Швеция).722.3. Методы исследования функциональной пригодности68Ga-цитрата на биологических тест-системахИзучение функциональной пригодности68Ga-цитрата проводилось наживотных с различными моделями воспаления (по п. 2.2.1-2.2.4), выбранныхв период поисковых исследований, и основывалось на определениидинамики биораспределения РФП, его аккумуляции и экскреции из очагавоспаления и различных органов и тканей, и, как следствие, расчетеэффективных и биологических периодов полувыведения препарата.Для доказательства эффективности применения68Ga-цитрата былпоставлен ряд экспериментов.2.3.1.