Автореферат (Взаимоотношения геномной ДНК и липидов - влияние факторов окружающей среды), страница 4

2 и 3) следует, что уровень 14:0 и 16:0 кислоточень чувствителен к изменению температуры как в логарифмической, так и встационарной фазах. 14:0 кислота исчезает в логарифмической фазе при 34 оС (встационарной фазе ее нет). Содержание 16:0 кислоты начинает уменьшаться влогарифмической фазе при 37 оС, а в стационарной фазе ‒ при 24 оС; при 37 оС онауже не определяется. Следует отметить, что при 48 ч культивирования (чтосоответствует поздней стационарной фазе или образованию спор) в ЖК-составеостаются лишь две кислоты ‒ 15:0 изо (46,8%) и 15:0 антеизо (53,2%) (данные нетабулированы). Содержание 15:0 изо и 15:0 антеизо кислот изменяется незначительнопри увеличении как температуры (в обеих фазах), так и времени культивирования, атакже при переходе от поздней логарифмической фазы к поздней стационарной фазе.Соотношение этих кислот оказалось практически одинаковым при всех температурахи фазах роста и поэтому не может быть использовано в качестве маркера (табл.

1)(Ибрагимова и др., 2012а; Russel, Fukunaga, 1990; Van de Vossenberg, 1999).Таким образом, в качестве биомаркеров фазы роста штамма B. subtilis OSU-142можно использовать 14:0 кислоту, которая характеризует логарифмическую фазу, и16:0 кислоту, характерную для стационарной фазы. Для обеих фаз роста содержание17:0 изо и 17:0 антеизо кислот с температурой растет немонотонно (однако в позднейстационарной фазе роста бактерий они не определяются). Содержание 15:0 изо и 15:0антеизо кислот почти постоянное в обеих фазах, резко увеличивается только впоздней стационарной фазе. В качестве биомаркера фазы роста при разныхтемпературах для этой бактерии предлагается использовать отношение 15:0антеизо/17:0 антеизо кислот (Ибрагимова и др., 2012).Жирнокислотные маркеры общих липидов грамотрицательной бактерииPseudomonas aurantiaca в зависимости от температуры и фазы ростаДля поиска маркеров фазы роста и влияния температуры на мембранныелипиды среди жирнокислотного состава грамотрицательной бактерии Pseudomonasaurantiaca нами был выбран штамм В-1558.

Методом газовой хроматографии сиспользованием стандартного набора жирных кислот и базы данных MIDI мыисследовали жирнокислотный профиль (МЭЖК) экстрактов общих липидов этойбактерии. На рис. 4 представлены результаты определения МЭЖК общих липидовP. aurantiaca В-1558 в логарифмической фазе роста (24 часа), на рис. 5 –в стационарной фазе роста (36 часов) при различных температурах.18Рис. 4. Изменение жирнокислотного состава общих липидов Pseudomonas aurantiaca В-1558с увеличением температуры, логарифмическая фаза (24 ч). По оси абсцисс – температура, оС,по оси ординат – содержание жирной кислоты, мол. %, номера по порядку: 1 – 10:0 3ОН; 2 –12:0; 3 – 12:0 2ОН; 4 – 12:1 3ОН; 5 – 12:0 3ОН; 6 – 15:0 изо 2OH/16:1ω7c; 7 – 16:0; 8 –18:1ω7c.Рис. 5.

Изменение жирнокислотного состава общих липидов Рseudomonas аurantiaca В-1558с увеличением температуры, стационарная фаза (36 ч). По оси абсцисс – температура, оС, пооси ординат – содержание жирной кислоты, мол. %. Номера по порядку: 1 – 10:0 3ОН; 2 –12:0; 3 – 12:0 2ОН; 4 – 12:1 3ОН; 5 – 12:0 3ОН; 6 – 15:0 изо 2OH/16:1ω7c; 7 – 16:0; 8 –18:1ω7c.19Втабл. 2 приведены величины отношений содержания жирных кислот,которые в сумме составляют 80% МЭЖК-профиля общих липидов P. aurantiacaВ-1558.

Для этих данных характерен рост отношения содержания 16:0 и суммыкислот 15:0 изо 2OH и 16:1ω7c при увеличении температуры с 24 оС до 37 оС ‒ с 0,77(24 оС) до 1,21 (37 оС).Поскольку в наших экспериментах кислота 16:1ω7cпредставлена как смесь с другой кислотой 15:0 изо2OH, мы предлагаем использоватьв качестве температурного биомаркера P. aurantiaca Nakhimovskaya 1948 ипредставителей рода Pseudomonas другое отношение, а именно 16:0/18:1ω7c. Этоотношение также увеличивается при изменении температуры роста бактерии: почти вдва раза при увеличении температуры на 10 оС (Жданов и др., 2012; Baysse et al.,2007).Таблица 2Биомаркерные жирные кислоты и их соотношение в МЭЖК-составе общих липидовграмотрицательной бактерии Pseudomonas aurantiaca B-1558 при различныхтемпературах и в зависимости от фазы ростаЖирные кислоты24 ºC35,4415:0 изо2ОН/16:1ω7с16:0*18:1ω7c16:0/15:0 изо2ОН/16:1ω7с*16:0/18:1ω7cФазы ростаЛогарифмическая*28 ºC34 ºC37 ºC35,9235,7645,2Стационарная**24 ºC28 ºC34,9735,1627,4317,2529,6915,8135,2313,0354,8–24,0517,6328,0415,640,771,590,831,880,982,701,21–0,691,360,801,79* ‒ 24 ч культивирования.

** ‒ 36 ч культивирования.Таким образом, величина отношения 15:0 антеизо / 17:0 антеизо кислот общихлипидов представляет собой маркер фазы роста штамма Bacillus subtilis OSU_142, этавеличина имеет тенденцию уменьшаться при увеличении температуры (24 оС, 28 оС,34оС, 37оС и 39оС). Предложено использовать в качестве температурногобиомаркера штамма Pseudomonas aurantiacа Nakhimovskaya 1948 соотношениесодержания 16:0 / 18:1ω7c кислот.Жирнокислотные и липидные профили фракций ДНК-связанных липидовграмотрицательной бактерии Pseudomonas aurantiacaДетергентныйметод.Известно,чтоосновнымикомпонентаминадмолекулярного комплекса ДНК (нкДНК) являются ДНК (79‒88%), РНК (10–15%),20белки (1–3%) и липиды (1–3%) (Struchkov et al., 2002). Для идентификации и анализалипидов по МЭЖК-профилю мы независимо обрабатывали нкДНК или ДНКазой I,или РНКазой А, или протеиназой К и исследовали профиль метиловых эфировжирныхкислотполученнойфракции.Намиобнаружено,чтоосновнымикомпонентами ЖК профиля ДНК-связанных липидов препарата геномной ДНК,выделенного детергентным методом, являются кислоты ‒ 16:0 и 18:0, а 10:0, 11:0 2OH,13:1 и 13:0 2OH кислоты содержатся в меньшем количестве (рис.

6) (Жданов и др.,2012; 2014; 2015).Из данных, представленных на рис. 6, А‒Г, можно определить маркерныеМЭЖК для каждой группы липидов, связанных с биомакромолекулами‒гидроксикислоты 11:02ОН и 13:02ОН входят в состав липидов, связанных с белками,14:1ω5с – связаных с белками и РНК, а 15:1ω8с – связанных с ДНК (Жданов и др.,2014).Этот способ позволяет установить ЖК-состав липидов, прочносвязанных сДНК, которые остаются после обработки нкДНК различными гидролизующимиферментами.

Полученные результаты впоследствии могут быть использованы приразработке новых методов диагностики заболеваний по липидному составу ДНКсвязанных липидов пациента или новых типов лекарственных средств (Жданов и др.,2014).Фенольный метод. В случае МЭЖК-профиля ДНК-связанных липидов нкДНК,выделенногофенольнымметодом,максимальнымсодержаниемобладаютнасыщенные кислоты: 12:0 (30%), 16:0 и 18:0 (по 15%), а минорными являютсялиноленовая кислота (2%), 12:1, 13:0 2ОН, 15:1 ω8C (по 3‒4%). После обработкиДНКазой I максимум содержания приходится на кислоты 16:0, 18:0 (по 26‒27%) и10:0 (12%).

Кислоты 16:0 и 18:0, так же как и в случае выделения детергентнымметодом, входят в состав всех групп липидов. Минорная кислота 15:1 ω8c входит всостав всех трех групп липидов, линоленовая кислота 18:3ω6с – в состав липидов,связанных с белками, а 11:0 iso3OH – в состав липидов, связанных с РНК и белками.Таким образом, способ выделения нкДНК влияет на ЖК-состав всех трех групплипидов (связанных с ДНК, РНК или белками), что может быть частично обусловленопереносом мембранных липидов к ДНК фенолом (Жданов и др., 2014; 2015).21АБВГРис. 6.

Идентификация и анализ липидов, прочносвязанных с ДНК, выделенных детергентнымметодом:А) содержание жирных кислот в необработанном ферментами образце комплексов ДНКс белками, РНК и липидами. По оси ординат (во всех рисунках) – содержание жирной кислоты(в %), по оси абсцисс – жирные кислоты, номера по порядку: 1 – 10:0, 2 – 11:0 2ОН, 3 – 13:1(12, 13), 4 – 13:0 2ОН, 5 – 16:0, 6 –18:0;Б) содержание жирных кислот в обработанном ДНКазой I образце комплексов ДНКс белками, РНК и липидами. По оси абсцисс – жирные кислоты, номера по порядку: 1 – 10:0,2 – 11:0 2ОН, 3 – 14:0, 4 – 14:1ω5с, 5 – 16:0, 6 – 18:0;В) содержание жирных кислот в обработанном РНКазой А образце комплексов ДНКс белками, РНК и липидами. По оси абсцисс – жирные кислоты, номера по порядку: 1 – 10:0,2 – 13:0 2ОН, 3 – 14:0, 4 –15:1ω8с, 5 – 16:0, 6 – 18:0;Г) содержание жирных кислот в обработанном протеиназой К образце комплексов ДНКс белками, РНК и липидами. По оси абсцисс – жирные кислоты, номера по порядку: 1 – 10:0,2 – 14:0, 3 –15:1ω8с, 4 – 16:0, 5 – 18:0, 6 – 18:3ω6с.22Жирнокислотный и фосфолипидный профили фракций липидов,прочносвязанных с ДНК грамотрицательной бактерии Pseudomonas aurantiacaЖирные кислоты.ЖирнокислотныепрофилифракцийДНК-связанныхлипидов P.

aurantiaca, определенные методом газовой хроматографии (Жданов и др.,2006; 2014; Zhdanov et al., 2001; Zhdanov et al., 2006) (базовые жирные кислотысложных липидов 14:0, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1 во фракциях 1 и 2) и методом массспектрометрии LC-ESI-MS (базовые свободные жирные кислоты, не входящие всостав сложных липидов: 16:0 и 18:1 во фракции 1 и кислоты 14:0, 16:1 и 18:2 вофракции 2), различаются и дополняют друг друга, что поможет глубже изучить рольДНК-связанных жирных кислот и липидов в функционировании хроматина (Жданови др., 2014; 2015).Фосфолипиды. В настоящем исследовании впервые реализован подход кисследованию липидома «хроматина» прокариотической клетки, основанный наизучении липидного профиля ДНК-связанных липидов методом масс-спектрометриис использованием электроспрэй ионизации (ESI-LC-MS). Этим методом мы, вопервых, подтвердили полученныеранее данные о липидном профиле ДНК-связанных липидов, и во-вторых, обнаружили, что для обеих фракций ДНКсвязанных липидов характерно наличие фосфатидилглицерина, фосфатидилсерина илизо-фосфатидилинозитола.