Диссертация (Повышение стабильности аналитического сигнала и миниатюризация вольтамперометрических сенсоров для определения глюкозы и пероксида водорода)

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТна правах рукописиНиколаев Константин ГеннадьевичПОВЫШЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ АНАЛИТИЧЕСКОГО СИГНАЛА ИМИНИАТЮРИЗАЦИЯ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ СЕНСОРОВ ДЛЯОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ И ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА02.00.02 – Аналитическая химияДиссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучный руководитель:доктор химических наук, профессор С.С.

ЕрмаковСанкт-Петербург2016Введение .............................................................................................................. 51. Обзор литературы ..................................................................................... 101.1. Электрохимические биосенсоры ............................................................. 101.2. Ферментные электрохимические сенсоры ............................................ 121.2.1. Развитие электрохимических биосенсоров .....................................

121.3. Виды рабочих электродов используемых ввольтамперометрических сенсорах для определения глюкозы ................. 201.3.1. Биосенсоры на глюкозу на основе глюкозоксидазы и наночастицзолота ...................................................................................................................... 291.3.2. Химические методы синтеза наноструктур золота сиспользованием олеиламина для электрохимических биосенсоров ...... 321.3.3.

Методы иммобилизации наноструктур золота и глюкозоксидазына поверхности электрода ............................................................................... 341.4. Бесферментные электрохимические сенсоры ...................................... 341.4.1. Применение наноструктур в электрохимических сенсорах .............. 351.5. Бесферментные сенсоры для определения пероксида водорода.......

361.6. Новые подходы для миниатюризации бесферментных ЭХ сенсоров391.6.1. Направленный электрохимический синтез наноструктур .......... 401.6.2. Миниатюризированные системы для определения пероксидаводорода в среде клеточных культур............................................................ 442. Методическая часть ................................................................................. 462.1. Оборудование и реактивы ........................................................................ 462.1.1. Приготовление растворов .................................................................. 472.1.2. Оборудование ........................................................................................

492.2. Методы синтеза наноструктур и модификации электродов ............. 512.2.1. Синтез наноструктур золота олеиламиновым методом ............... 512.2.2. Изготовление электродов для DENA синтезананоструктурированных ультрамикроэлектродов ................................... 612.2.3. Синтез наноструктурированных УМЭ методом направленногоэлектрохимического осаждения .....................................................................

642.3. Иммобилизация глюкозоксидазы на поверхности электрода........... 6912.4. Изоляция металлических контактов..................................................... 712.5. Способы задания концентраций и техника электрохимическихизмерений...............................................................................................................

732.5.2. Электрохимические ячейки для электрохимических измеренийна электродах синтезированных DENA-методом ....................................... 753. Результаты эксперимента и их обсуждение......................................... 773.1. Определение эффективной площади поверхности наноструктур,полученных олеиламиновым методом ............................................................ 773.1.1. Исследование изменения эффективной площади поверхностиэлектродов модифицированных наночастицами золота .......................... 773.1.2. Изучение поверхности модифицированных электродов методомспектроскопии электрохимического импеданса ........................................

823.2. Исследование состава и структуры наноструктурированных УМЭсплава Pd-Au ......................................................................................................... 873.2.1. Рентгеноспектральные исследования наноструктурированныхУМЭ сплава Pd-Au ............................................................................................

873.2.2. Исследование проводимости наноструктурированных УМЭсплава Pd-Au ...................................................................................................... 964. Исследование аналитических характеристик наноструктурированныхэлектродов. ........................................................................................................ 994.1.

Аналитические характеристики вольтамперометического сенсора симмобилизованной глюкозоксидазой на примере определения глюкозы994.1.1. Расчет каталитической активности глюкозоксидазы из данныхполученных при определении глюкозы ..................................................... 1084.2. Исследование аналитических характеристик электродов на основенаноструктурированных УМЭ Au, Pd сплава Pd-Au на примерепероксида водорода ............................................................................................ 1094.2.1. Аналитические характеристики амперометрического сенсора наоснове наноструктурированных УМЭ на примере бесферментногоопределения пероксида водорода................................................................. 1104.2.2.

Определение внеклеточной концентрации пероксида водородапри гипоксии клеток HL-1 ............................................................................ 117Выводы ............................................................................................................ 119Список литературы....................................................................................... 1202Перечень условных сокращений и обозначенийАМ - амперометрияИКН - ионно-коллоидное наслаиваниеИМП - импедансИН - ионное наслаиваниеКН - коллоидное наслаиваниеЛИ - линейный интервалМУН - многостенные углеродные нанотрубкиМОУН – смесь многостенных и одностенных углеродных нанострубокНЧ - наночастицыОУН - одностенные углеродные нанотрубкиПА - полианилинПАБС - полиакрилонитрил бутадиен стиролПАДА - полиадамантилакриламидПАМАМ - дендример 4- полиамидоаминПАС - поли - (р- ацетоксистирол)ПАУ - полициклические ароматические углеводородыПБВ - полибутиленвиологенПВ - поливиниловый спиртПВ - поливинилПВС - поливинилсульфоновая кислотаПГЭ - пиролизированный графитовый электродПДДА - хлорид полидиаллилдиметиламмонияПЕДОТ - poly(3,4-ethylenedioxythiophene)ПО - предел обнаруженияПОМ - полиоксометаллатыПП - полипироллПРО - преобразователь сигнала - трансдьюсерПС - полистиролПСС - полистиролсульфонат3ПХС - послойная химическая сборкаПЭИ - полиэтилениминСДГ - слоистый двойной гидроксидСО-ПП – сверхокисленный полипироллСПАН – сульфонированный полианилинСТБ - стабильностьСУЭ - стеклоуглеродный электродСЭИ - спектроскопия электрохимического импедансаТМАК - N-триметоксисилипропил-t-N,N,N-триметиламмония хлоридTO - время откликаЦВА - циклическая вольтамперометрияЧС - чувствительный слойЭБС - электрохимический биосенсорЭС - электрохимический сенсорЭЭС – электрод электрохимического сенсораУМЭ – ультрамикроэлектродCyt c - Цитохром ЦEDX – энергодисперсионная рентгеновская микроскопияGOX - глюкозоксидазаGSGHs – нанослои мезопористого графена и кремнияHEPES- 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислотаHRP - пероксидаза хренаITO - In-Sn оксидS – чувствительностьSEM – сканирующая электронная микроскопияTDA-SiCl – тетрадецилдиметил[3-(триметоксисилил)пропил] аммония хлоридTMAH – тетраметиламмония гидроксидVpp – величина размаха переменного напряжения, В4ВведениеСовременная медицинская диагностика требует постоянного контроляпоказателей глюкозы в крови человека.

В настоящее время для этих целейиспользуют коммерческие ферментные электрохимические сенсоры на основеглюкозоксидазы. Сенсор как устройство электрохимического детектированияможет осуществлять инвазивный биохимический анализ in vivo. Кроме того,электрохимические сенсоры позволяют пользователю проводить экспрессныйанализ в домашних условиях. Не смотря на это, они обладают такиминедостаткамикак:низкаяточностьопределения(сотносительнойпогрешностью до 30%) и короткий срок службы (до 2 месяцев). Низкаяточностьопределенияглюкозыобъясняетсямешающимвлияниембиологически активных веществ.

В связи с тем, что в коммерческих сенсорах вкачествеактивностьэлектродовиспользуютиммобилизованнойнатонкопленочныенихзолотыеглюкозоксидазыэлектроды,оченьбыстроуменьшается во времени. Этим можно объяснить низкий срок годности такихсенсоров. Низкая воспроизводимость поверхности тонкопленочных электродов,которые производят методом вакуумного напыления, требует отдельнойградуировки для каждой партии сенсоров. Всё вышеперечисленное такжевлияет на точность определения концентрации глюкозы в крови.Использование электродов модифицированных наноструктурами золотапозволяет решить эти проблемы.

Такие электроды имеют большую площадьповерхности за счет трехмерной структуры наночастиц и нанопроволок золота.Благодаряэтомудостигаетсявоспроизводимостьповерхностимодифицированного электрода. Как известно, наноразмерные частицы золотапредотвращают денатурацию глюкозоксидазы и поддерживают постояннуюконформацию этой молекулы, что приводит к увеличению стабильностибиосенсора во времени. Кроме того, за счет увеличения поверхности,электроды,модифицированныенаноструктурамизолота,обеспечиваютвысокую точность и чувствительность электрохимического сенсора дляопределения глюкозы. Таким образом, разработка сенсоров на основе5электродов модифицированных наноструктурами золота, используемых дляопределения глюкозы является перспективным направлением.Существуетмножествоспособовсинтезананоструктурзолота.Наименьший диаметр наночастиц и нанопроволок обеспечивают методыхимическогосинтезасостерическойстабилизациейнаноструктурповерхностно активными веществами (ПАВ).

При этом существует проблемаиспользования таких наноструктур для модификации электродов, связанная сгидрофобностью стабилизирующих ПАВ. Гидрофобные ПАВ на поверхностинаноструктур золота блокируют перенос заряда и уменьшают рабочую площадьповерхности модифицированного электрода.Для контроля биологически активных веществ (БАВ) на внеклеточномуровне требуется миниатюризация и биосовместимость электрохимическихсенсоров. Одними из наиболее важных БАВ являются активные формыкислорода (АФК). АФК - это побочные продукты аэробного метаболизма вбиологических системах.

К АФК относят синглетный кислород, гидроксилрадикал и пероксид водорода. Пероксид водорода образуется из анионовсупероксида, которые являются продуктами восстановления кислорода вовремя аэробного дыхания. Пероксид водорода - наиболее стабильная активнаяформа кислорода, поэтому он является наиболее подходящим аналитом дляэлектрохимических сенсоров. Однако прямое электрохимическое определениепероксида водорода проводят при достаточно высоких потенциалах, что вбиологических средах может привести к окислению или восстановлениюдругих электроактивных веществ, присутствующих в этих средах. В этомслучае снижение потенциала детектирования пероксида водорода достигаетсяза счет использования наноструктур благородных металлов в конструкцииэлектрохимических сенсоров. Поэтому, модификация миниатюрных электродовнаноструктурамиблагородныхметалловилиполучениенаноструктурированных ультрамикроразмерных электродов позволят создаватьэлектрохимическиесенсорыдляопределенияпероксидаводородавбиологических средах.6Цель работы: Разработка новых вольтамперометрических сенсоров наосновенаноструктурзолотадляопределенияглюкозыинаноструктурированных ультрамикроэлектродов (УМЭ) палладия, золота и ихсплава для определения пероксида водорода.Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующиезадачи:разработать метод активации наночастиц золота, синтезированных-олеиламиновым методом;- модифицировать электрод наночастицами золота и активировать полученнуюнаноструктурированную поверхность реагентом Меервейна;- на основе полученного модифицированного электрода разработать прототипвольтамперометрического биосенсора на глюкозу и изучить его аналитическиехарактеристики;- выбрать оптимальные условия для метода направленного электрохимическогосинтеза наноструктур Pd, Au и их сплава, создать миниатюризированныйбесферментный вольтамперометрический сенсор на их основе;-изучитьаналитическиевольтамперометрическиххарактеристикисенсоровнаполученныхпримеребесферментныхопределенияпероксидаводорода;- разработать миниатюризированный вольтамперометрический сенсор наоснове наноструктур Pd, Au и их сплава, для определения уровня гипоксииклеток.Научная новизна- впервые для удаления молекул гидрофобных реагентов с поверхностинаноструктурAuпримененметодобработкиреагентомМеервейна(тетрафторборат триэтилоксония), что привело к улучшению аналитическиххарактеристиквольтамперометрическихсенсоровнаосноветакихнаноструктур;- впервые получены и охарактеризованы УМЭ на основе Au, Pd и сплава Pd-Auдля создания вольтамперометрических сенсоров для определения пероксидаводорода.