Диссертация (1150338), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Бесферментный сенсор имеет высокую чувствительность (4,1767мA·мM-1cм-2), низкий предел обнаружения (2,4·10-7 М) и широкий диапазонлинейной зависимости концентрации пероксида водорода (от 1,0·10 -6 до 1,0·10-3М)Практическая значимость работы:- разработан вольтамперометрический сенсор на основе наночастиц золота споверхностью, предотвращающей денатурацию глюкозоксидазы, что привело кувеличениювременистабильнойработыбиосенсорадо60дней,чувствительности (до 15,0 мкA·мM-1cм-2) , а также снижению пределаобнаружения глюкозы до 0,02 мМ;-на основе наноструктурированногоУМЭсплаваPd-Auразработанминиатюрный амперометрический сенсор для бесферментного определенияпероксида водорода в объеме 100 мкл при низком потенциале детектирования(минус 0,05 В).Положения, выносимые на защиту- способ обработки наноструктур Au для удаления олеиламина сприменением реагента Меервейна- аналитические характеристики вольтамперометрического сенсора дляопределения глюкозы на основе наночастиц золота активированныхреагентом Меервейна- аналитическиехарактеристикисинтезированныхметодомнаноструктурированныхнаправленногоУМЭ,электрохимическогоосаждения, на примере определения пероксида водородаАпробация работыОтдельные разделы диссертации докладывались на VIII Всероссийскойконференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международнымучастием"Менделеев-2014"(Санкт-Петербург,2014),Международнойконференции «1st International School and Conference on Optoelectronics,Photonics,Engineeringandnanostructures»(Санкт-Петрбург,2014),Международной конференции «Nanoelectronic Days» (Juelich, Германия, 2015),II Съезд Аналитиков России (Москва), IX всероссийской конференции по8электрохимическимметодаманализасмеждународнымучастиемимолодежной научной школой «ЭМА 2016».ПубликацииОпубликовано 11 работ, в том числе 6 статей в рецензируемых научныхжурналах, из них по теме диссертации – 3 рекомендованных ВАК, 5 тезисовдокладов на научных конференциях.
Работы частично выполнялись в рамкахгранта СПбГУ-DAAD №12.42.1438.2015.91. Обзор литературы1.1.Электрохимические биосенсорыЭлектрохимическимэлектрохимическимбиосенсоромтрансдьюсеромназываютбиосенсор(физическимспреобразователем).Электрохимический биосенсор состоит из полупроводников или проводниковпервогоилибиологическийвторогорода,материалкоторыевсодержаткачествебиохимическийреагентсодержащейилифазы.Электрохимические сенсоры, как известно, занимают в химической сенсорикеособое место и в настоящее время нашли широкое применение в различныхобластях анализа , начиная от анализа воздуха рабочей зоны [1, 2], определениятоксичных веществ и патогенов (в окружающей среде и продуктах питания) изаканчивая in situ анализом физиологических жидкостей, который важен вмедицинской диагностике [3-9].
Принцип работы амперометрического сенсораоснован на измерении тока, возникающего в результате электрохимическогоокисления или восстановления электроактивных веществ. Это обычнореализуется поддержанием постоянного потенциала на множестве электродовотносительноэлектродасравнения,которыйможеттакжеслужитьвспомогательным электродом (противоэлектродом), если токи низки (от 10-9 до10-6A).Получающийсятоксоответствуетобщейконцентрацииэлектроактивного вещества или продукту реакции этого же вещества, илискорости потребления электроактивного вещества в пределах смежногобиокаталитического слоя. Биокаталитические реакции выбираются так, чтобыони характеризовались первым порядком скорости, такие стационарные токиобычно пропорциональны объемной концентрации аналита. Современныйэлектрохимический сенсор (ЭС) [10, 11] можно представить следующимобразом: устройство, (рисунок 1), содержащее мембрану (иногда газовый зазор)селективную по физическим характеристикам - агрегатному состоянию,размеру частиц и т.п.; далее чувствительный слой (ЧС), в котором происходятхимические или биологические реакции, обеспечивающие селективностьопределения;последняячасть–трансдьюсер,другимисловами10преобразователь(ПРО).ПРО-устройство,преобразующееоткликраспознающего элемента (физической или химической природы) в измеряемыйсигнал (как правило, электрический), величина которого пропорциональнаконцентрации определяемого вещества или веществ.
Довольно часто сложнопровести четкую границу между ЧС и ПРО, так как в ряде конструкций ЭСфункцию ЧС выполняет ПРО, что наблюдается в работах последних лет побесферментным сенсорам [12]. ЭС можно представить в виде миниатюрногоаналитического устройства, в котором мембрана осуществляет стадиюпробоотбора, ЧС – осуществление сигналобразующего процесса, а ПРО играетроль инструмента получения аналитического сигнала или метода конечногоопределения.Рисунок 1. Схема устройства электрохимической ячейки.11Вкачествеинструментальныхпотенциометрия,амперометрия,методоввЭСвольтамперометрия,используютсяспектроскопияэлектрохимического импеданса, кулонометрия и кондуктометрия. Наиболеераспространенными являются амперометрические сенсоры, в частности дляопределения глюкозы.1.2.Ферментные электрохимические сенсорыФерментные электрохимические сенсоры применяются для определениябольшого количества аналитов.
Одним из наиболее распространенных иизученных биосенсоров является сенсор для определения глюкозы. В егоконструкцииобеспечиваетвкачествевысокуюферментаиспользуютселективностьпоглюкозоксидазу,отношениюкчтодругимэлектроактивным частицам в биологических жидкостях.Сахарный диабет стал прогрессирующим заболеванием за последниегоды, что и определило широкое применение на практике сенсоров на глюкозу.Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, около 350миллионов человек во всем мире больны диабетом, и, по текущим прогнозам,диабет будет седьмой ведущей причиной смерти в 2030 году [13]. Точноеизмерение и тщательный контроль уровня глюкозы в крови имеют важноезначение для правильной диагностики и лечения сахарного диабета. Типичныйанализ крови в глюкометрах проводится с помощью небольшого образца крови,который обычно получают посредством укола пальца.
Кровь затем подводитсяк одноразовой тест-полоске под действием капиллярных сил. Большинство изэтих тестов основано на ферментативном методе, в котором полоски состоятилииздегидрогеназыглюкозы(GDH)илиглюкозоксидазы(GOX),иммобилизованных на печатном электроде.1.2.1. Развитие электрохимических биосенсоровОбычно выделяют три поколения биосенсоров [4]. Первое поколениебазировалось на определении кислорода, образующегося или потребляемого врезультате ферментативной реакции. Второе поколение содержит медиаторы12электронного переноса, позволяющие снизить энергию активации переносаэлектрона от фермента к электроду.
Третье поколение основано на прямомпереносе электрона с электрода на активный центр фермента или наоборот.Один из первых электрохимических биосенсоров был предназначен дляопределения глюкозы. Устройство сенсора было предложено в 1962 годуКларком и Лионом [14]. Этот сенсор состоял из электрода Кларка, нагазопроницаемую мембрану которого нанесен тонкий слой глюкозоксидазы.Концентрация глюкозы определялась по изменению потребляемого кислорода врезультате ферментативной реакции глюкозы с кислородом, продуктамикоторой являются глюконовая кислота и пероксид водорода.Технология Кларка была передана компании Yellow Spring InstrumentCompany (YSI), которая в 1975 году начала выпуск приборов для определенияглюкозы в 25 мкл крови.
Апдайк и Хикс [15] развили дальнейшие принципы сиспользованием двух кислородных рабочих электродов (на один из которыхбылнанесенфермент)иизмерениемдифференциальноготокадлякорректировки фона кислорода в различных образцах. В 1973 году Гильбо иЛабрано [16] описали ферментный электрод для определения глюкозы в кровиамперометрическим методом по количеству окисленного пероксида водорода:Хорошая точность и воспроизводимость были получены при объемеанализируемой крови в 100 мкл. Широкий диапазон концентраций, измеряемыйс помощью амперометрических сенсоров, зависит от геометрии электрода,состава мембраны или способа иммобилизации фермента.
В течение 1980-хгодовпроисходилоЗначительныеразвитиеусилия,набиосенсоровпротяженииввсегообластиэтогобиотехнологий.времени,былисфокусированы на биосенсорах, основанных на медиаторах переноса электрона(биосенсоры второго поколения). Тогда же начался выпуск тест-полосок длясамостоятельного контроля уровня глюкозы в крови и использование13модифицированных электродов для усиления сигнала электрохимическогодатчика. В 1990-х годах возрос интерес к возможности переноса электронанепосредственно с редокс-центра глюкозоксидазы на поверхность электрода.Таким образом, биосенсоры первого поколения были основаны наопределении глюкозы по реакции с кислородом, катализируемой природнымсубстратом, и на определении выделившейся перекиси водорода.
Такойпростой принцип в основном использовался при миниатюризации сенсоров. Вобщей конфигурации исследований YSI глюкозоксидаза находилась междупроницаемой изнутри мембраной из ацетата целлюлозы и внешней мембранойизбиологическисовместимогополикарбоната,котораяограничиваладиффузию.Амперометрическоеизмерениеконцентрациипероксидаводородапроводится при потенциале плюс 0,2 В (относительно хлорсеребряногоэлектрода сравнения).
При этом потенциале уменьшается влияние такихэлектроактивных веществ, как аскорбиновая кислота, мочевая кислота иацетаминофен (и др. наркотические вещества). Анодные токи этих и другихкомпонентовбиологическихжидкостей,способныхокисляться,могутуменьшить селективность и, следовательно, внести ошибку в величину сигналасенсора.
Один из способов устранения низкой селективности - применениеполупроницаемого слоя, что уменьшает доступ мешающих веществ кповерхности преобразователя. Различные полимеры (мультислои и смешанныеслои) с такими качествами, как размер, заряд или поляризация, использовалисьдляповышенияселективности.Полупроницаемыеслоиисключалиповерхностно активные макромолекулы, тем самым увеличивая стабильностьработы сенсора. Пленки, синтезированные электрополимеризацией, особеннополифенилендиамина и сверхокисленного полипиррола, используются дляобеспечения высокой селективности по размеру молекул. Другие широкоиспользуемые покрытия, основанные на селективности по размеру, – это ацетатцеллюлозыилиотрицательнозаряженный(сульфонированный)полиэлектролит Nafion, Kodak AQ или гидрофобный алкантиол, липидные14слои. Использование мультислоев, обладающих различными свойствами, даетнекоторые преимущества.
Например, смешение Nafion и ацетата целлюлозыбыло использовано для устранения влияния нейтрального ацетаминофена иотрицательно заряженных аскорбиновой и мочевой кислот. На протяжении1990-х годов исследованияв этойобласти были сосредоточены наэлектрокаталитическом определении пероксида водорода. Это позволилоопределить оптимальную область потенциалов (от 0 доминус 0,2 В похлорсеребряному электроду), в которой мешающие реакции оказываютнаименьшее влияние. Электроды, состоящие из металлизированного углеродагексацианоферратомрутения и гексацианоферратом родия, повышалиселективность к глюкозе [17]. Таким образом, была получена высокаяселективность и быстрый отклик сенсора для определения глюкозы.Работа сенсоров, содержащих оксидазы, основана на потреблениикислорода, это может снижать сигнал сенсора, что связанно с парциальнымдавлениемкислородаиегоколичественнымнедостаткомдлястехиометрической реакции. Эти отклонения оказывают влияние на времяотклика сенсора и снижают верхнюю границу диапазона линейности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
