Автореферат (Изучение роли транскрипционного фактора KNOX 3 в процессе органогенеза клубеньков бобовых растений), страница 4

Показано, что экспрессия MtIPT3/4/5 в листьяхувеличивается в ответ на инокуляцию, что говорит о возможном участии этих генов в AON.При этом увеличение экспрессии этих генов в разных повторностях наблюдается на разныхсроках: на 5 или 7 дпи. Мы полагаем, что временная динамика развития клубеньков можетварьировать в зависимости от условий выращивания растений в разных экспериментах, ивремя активации AON может меняться соответственно.Рисунок 8 - Уровни экспрессии генов MtIPT3,4,5 в листьях в ответ на инокуляцию у растенийдикого типа.

На рисунке представлены результаты двух биологических повторностей (А иБ).NI-3d, -5d, -7d, -10d – контроли без инокуляции на соответствующих сроках.Для проверки того, зависит ли увеличение экспрессии генов MtIPT3/4/5 в побеге от AON,экспрессия этих генов была проанализирована у суперклубенькообразующего мутанта sunn-3,несущего мутацию в гене CLV1-подобой рецепторной киназы, которая необходима длявосприятия CLE-пептидов и последующего синтеза цитокинина в побеге.

Мы показали, чтоэкспрессия MtIPT3 не увеличивается у мутанта sunn-3, что указывает на то, что экспрессияэтого гена в побеге может регулироваться с участием киназы SUNN. При этом, увеличениеэкспрессии MtIPT4 и MtIPT5 сохранялось у мутантов sunn-3, то есть экспрессии этих генов независит от киназы SUNN в побеге (Рисунок 9).13Рисунок 9 - Уровни экспрессии генов MtIPT3/4/5 в листьях в ответ на инокуляции усуперклубенькообразующего мутанта sunn-3.

NI-3d, -5d, -7d, -10d – контроли без инокуляциина соответствующих сроках.Для проверки того, могут ли транскрипционные факторы KNOX быть вовлечены вактивацию экспрессии генов MtIPT в побеге, необходимо было прежде всегопроанализировать экспрессию всех генов MtKNOX в листьях на разные дни после инокуляцииризобиями. Мы наблюдали увеличение экспрессии генов MtKNOX3/5/9 в листьях в ответ наинокуляцию при этом время их активации совпадает с активацией гена MtIPT3 в разныхповторностях (Рисунок 10).Рисунок 10 - Уровни экспрессии генов MtKNOX3,5,9 в листьях в ответ на инокуляцию урастений дикого типа.

На рисунке представлены результаты двух биологическихповторностей (А и Б). NI-3d, -5d, -7d, -10d – контроли без инокуляции на соответствующихсроках.У суперклубенькообразующего мутанта sunn-3 не наблюдается увеличение экспрессииMtKNOX5/9 (Рисунок 11). Таким образом, можно предположить, что активация геновMtKNOX5/9 зависит от киназы SUNN в пути AON.14Рисунок 11 - Уровни экспрессии генов MtKNOX3,5,9 в листьях в ответ на инокуляцию усуперклубенькообразующего мутанта sunn-3. NI-3d, -5d, -7d, -10d – контроли без инокуляциина соответствующих сроках.На основании полученных данных можно предположить, что регуляторный модульKNOX-IPT работает не только в меристеме побега и в клубеньках, но и листьях при активациисистемы авторегуляции клубенькообразования.Кроме того, мы оценили уровни экспрессии генов MtIPT и MtKNOX в инокулированныхкорнях суперклубенькообразующего мутанта sunn-3.

Характер экспрессии генов MtIPT, атакже MtKNOX3/9 у мутанта sunn-3 был схож динамикой экспрессии этих генов у растенийдикого типа в формирующихся клубеньках. Однако, в клубеньках мутанта sunn-3 ненаблюдалось активации экспрессии MtKNOX5. Этот факт говорит о возможности контроляактивации экспрессии этого гена с участием киназы MtSUNN- компонента системыавторегуляции.Кроме того, экспрессия гена MtKNOX3 в формирующихся клубенькахсуперклубенькообразующего мутанта sunn-3 была изучена с использованием промотораMtKNOX3, слитого с репортерным геном GUS. На ранних стадиях развития клубеньков (3-5дпи), активность промотора MtKNOX3 наблюдалась в примордиях клубеньков, напоследующих этапах (7-9 дпи) − в апикальной зоне клубенька, а также в месте формированиябудущих проводящих тканей, также как в клубеньках растений дикого типа.

Однако, в зрелыхклубеньках у мутанта sunn-3 экспрессия MtKNOX3 была выявлена в меристеме клубеньков,что не наблюдалось у дикого типа (Рисунок 12). На основании этого, можно предположить,что локализация экспрессии MtKNOX3 в пределах клубенька регулируется с участием киназыSUNN.Рисунок 12 - Активность промотора MtKNOX3 в клубеньках на разных сроках развития усуперклубенькообразующего мутанта sunn-3, трансформированного с помощью конструкцииpMtKNOX3::GUS. Масштабная шкала, 100 мкм. Толщина срезов, 50 мкм.155.2. Изучение влияния подавления экспрессии гена MtKNOX3 с помощью интерференцииРНК на экспрессию генов CLE, активируемых при клубенькообразованииИзвестно, что CLE-пептиды вовлечены в авторегуляцию клубенькообразования.Показано, что экзогенный цитокинин, а также увеличение экспрессии MtLOG1 приводят кувеличению экспрессии гена MtCLE13 у люцерны, кодирующего CLE-пептид, подавляющийразвитие клубеньков.

Таким образом, что цитокинин также вовлечен в AON через активациюCLE-пептидов. Поскольку ранее в ходе выполнения работы мы показали, что ТФ MtKNOX3активирует экспрессию генов биосинтеза цитокинина при клубенькообразовании, вдальнейшем мы изучили влияние ТФ MtKNOX3 на экспрессию генов MtCLE, вовлеченных вклубенькообразование.Помимо генов MtCLE12 и MtCLE13, ранее охарактеризованных как негативныхрегуляторов клубенькообразования в AON, мы также изучали экспрессию ранеенеаннотированных генов CLE в формирующихся клубеньках. В результате мы показали, чтонаряду с MtCLE12 и MtCLE13, в ходе развития клубеньков происходит активация геновMedtr2g091125, Medtr2g437800, Medtr2g015445 и Medtr4g087850, кодирующих CLE-пептиды.Анализ экспрессия генов MtCLE в клубеньках на фоне РНК-интерференции MtKNOX3выявил значимое подавление экспрессии генов Medtr2g437800 и Medtr4g087850 (Рисунок 13).Таким образом, ТФ MtKNOX3 может быть вовлечен в регуляцию экспрессии генов,кодирующих CLE-пептиды, в ходе формирования клубеньков, что указывает на возможноеучастие этого ТФ в авторегуляции клубенькообразования.Рисунок 13 - Снижение уровней экспрессии генов Medtr2g437800 и Medtr4g087850 на фонеподавления экспрессии MtKNOX3 путём интерференции – РНК (MtKNOX3-RNAi) в клубеньках*** соответствует P value <0.05, <0.01 и <0.001, соответственно).ЗаключениеТранскрипционные факторы KNOX играют важную роль в развитии растений.

Известно,что гены KNOX важны для поддержания клеток апикальной меристемы побега внедифференцированном состоянии. Мишенями транскрипционных факторов (ТФ) KNOX(KNAT1, STM) в меристеме побега являются гены биосинтеза цитокинина (IPT) (Yanai, et al.,2005, Jasinski, et al., 2005). В настоящей диссертационной работе выдвинута гипотеза обучастии ТФ KNOX в активации генов биосинтеза цитокинина при развитии клубеньков.В нашей работе мы впервые показали участие транскрипционных факторов MtKNOX(MtKNOX3/5/9) в развитии клубеньков (Azarakhsh, et al., 2015). На основании полученныхданных мы предлагаем схему, объясняющую участие ТФ MtKNOX в развитии клубеньков иих место в авторегуляции клубенькообоазования (Рисунок 14).Среди проанализированных генов MtKNOX (MtKNOX1-10) для более подробногоизучения нами был выбран ген MtKNOX3, поскольку его экспрессия приклубенькообразовании повышается в значительно большей степени, чем экспрессия другихгенов MtKNOX.

Анализ активности промотора гена MtKNOX3 подтвердил наличие егоэкспрессии при формировании примордиев клубеньков, и на более поздних этапах развитияклубеньков - в месте формирования будущих проводящих тканей и меристемы клубенька.16Полученные нами результаты по экспрессии генов MtKNOX позднее были подтверждены вработе другой исследовательской группы (Di Giacomo, et al., 2016). Кроме того, была выявленаактивация экспрессия ряда генов MtIPT и MtLOG в клубеньках в ответ на инокуляцию(Azarakhsh et al., 2015; Azarakhsh et al., 2018). Данные по активации экспрессии LOG1/2 такжесогласуются с исследованием, опубликованным Mortier и соавторами в 2014г.

(Mortier, et al.,2014). Образование клубенькоподобных структур (спонтанные клубеньки) на трансгенныхкорнях со сверхэкспрессией MtKNOX3 и тот факт, что в этих структурах наблюдаетсяповышение экспрессии гена цитокининового ответа (RR4), а также генов MtIPT3 и MtLOG2,наряду с данными об уменьшении экспрессии этих генов в корнях с подавлением экспрессииMtKNOX3 путём интерференции РНК указывает на то, что ТФ MtKNOX3 вовлечён вактивацию биосинтеза цитокинина. В дополнение к этому, нам удалось показатьнепосредственное взаимодействие гомеодомена MtKNOX3 с предполагаемымипоследовательностями в промоторах или интронах генов MtIPT (MtIPT3/5) и MtLOG (LOG1/2)с помощью двух методов EMSA и SPR.

Эти данные в совокупности указывают на то, что геныбиосинтеза цитокинина являются прямыми мишенями ТФ MtKNOX3 (Рисунок 14).Уменьшение экспрессии гена цитокининового ответа RR4 в корнях с уменьшениемэкспрессии MtKNOX3 (MtKNOX3-RNAi) согласуется с данными, полученными в статьеGiacomo et al., 2016 при одновременном подавлении MtKNOX3/5/9/10 (MtKNAT3/4/5-like)методом интерференции РНК (Di Giacomo, et al., 2016).