Автореферат (Изучение роли транскрипционного фактора KNOX 3 в процессе органогенеза клубеньков бобовых растений)

На правах рукописиАзарахш МахбубехИзучение роли транскрипционного фактора KNOX3 в процессеорганогенеза клубеньков бобовых растенийСпециальность: 03.02.07 ГенетикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСАНКТ-ПЕТЕРБУРГ2018Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии в лаборатории генной и клеточнойинженерии растений биологического факультета Федерального государственногообразовательного учреждения высшего образования «Санкт-Петербургский государственныйуниверситет».Научный руководитель:Лутова Людмила Алексеевнадоктор биологических наук, профессор,профессор кафедры генетики и биотехнологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургскийгосударственный университет», г. Санкт-ПетербургОфициальные оппоненты:Карлов Геннадий Ильичдоктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАНврио директора ФГБНУ «Всероссийский научно исследовательский институтсельскохозяйственной биотехнологии», г.

МоскваХлесткина Елена Константиновнадоктор биологических наук, профессор РАНврио директора ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институтгенетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова» (ВИР), г. Санкт-ПетербургВедущая организация:ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им.М.В. Ломоносова», г.

МоскваЗащита состоится ”__”__________2018 г. в ____ часов на заседании совета Д.212.232.12 позащите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственномуниверситете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, биологическийфакультет __________________________________________________.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького СанктПетербургского государственного университета по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург,Университетская наб., 7/9 и на сайте Санкт-Петербургского государственного университетапо адресу: https://disser.spbu.ru/files/disser2/disser/hf30R0jJRk.pdf.Автореферат разослан ”__”__________2018 г.Ученый секретарьДиссертационного совета Д 212.232.12кандидат биологических наукС.А. Галкина2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемы.

Рост и развитие растений в постэмбриональный периодобусловлены наличием меристем, активность которых позволяет растениям образовыватьновые ткани и структуры на протяжении всей их жизни. Благодаря этому, растения, ведущиеприкрепленный образ жизни, способны адаптироваться к преобладающим условиямокружающей среды. Растительные клетки характеризуются высокой степеньютотипотентности: дифференцированные клетки могут дедифференцироваться и повторнодифференцироваться в другие типы клеток в ходе онтогенеза, что может сопровождатьсяформированием меристем de novo.

Одним из примеров формирования новых органов изакладки меристем de novo у растений является развитие азотфиксирующих клубеньков убобовых растений при симбиозе с почвенными бактериями ризобиями.Формирование симбиотического клубенька у бобовых растений представляет собоймодельную систему для изучения процессов пролиферации и дедифференциации клеток.Кроме того, симбиотические клубеньки представляют собой «фабрики», в которыхпроисходит уникальный процесс – биологическая фиксация молекулярного азота.

При этомсами по себе растения и животные не способны к биологической азотфиксации, и этот процесспроисходит в природе с участием ряда микроорганизмов и сине зелёных водорослей.Благодаря функционированию симбиотических клубеньков, в тканях бобовых растенийнакапливаются азотсодержащие органические соединения, белки, обуславливающие высокуюпитательную ценность этих культур. Поэтому бобовые растения имеют важное практическоезначение для сельского хозяйства и применяются в севообороте для обогащения почвы азотом,что позволяет снизить количество вносимых азотсодержащих удобрений. В связи с этим,изучение механизмов развития клубеньков бобовых растений представляется важным иактуальным и имеет как фундаментальное, так и практическое значение.Регуляция баланса пролиферирующих клеток в меристемах при развитии растенийосуществляется с участием транскрипционных факторов (ТФ) и гормонов. Изучениевзаимосвязи ТФ и гормонов как основных регуляторов развития растений является важнойзадачей биологии развития.Степень разработанности темы.

К числу важнейших групп ТФ относят гомеодоменсодержащие ТФ, в частности транскрипционные факторы семейств KNOX. ТФ KNOXотносятcя к семейству белков TALE с гомеодоменом. Впервые ТФ, содержащие гомеодомен,были описаны у животных как ключевые регуляторы развития. У растений ТФ KNOXизвестны как основные регуляторы функционирования побеговой апикальной меристемы(ПАМ).

Показано, что мишенями транскрипционных факторов (ТФ) KNOX в меристемепобега являются гены, кодирующие изопентинилтрансферазы (IPT), ферменты биосинтезацитокинина, гормона, играющего ключевую роль в поддержании активности апикальноймеристемы побега. Цитокинин также играет важную роль в развитии азотфиксирующихклубеньков, формирующихся на корнях бобовых растений. Известно, что компонентыцитокининного сигналинга активируются в ответ на Nod-фактор у бобовых растений.

Болеетого, недавно было показано, что цитокинин также вовлечён в систему авторегуляцииклубенькообразования (англ. Autoregulation of nodulation, AON): синтезируемый в побегецитокинин поступает в корень и подавляет образование клубеньков. У ряда бобовых растенийв ходе развития клубеньков была выявлена активация экспрессии генов IPT, а также геновLOG (LONELYGUY), кодирующих ферменты, необходимые для образования активных формцитокинина. Однако, возможные активаторы биосинтеза цитокинина в клубеньках неизвестны. Поскольку известно, что в меристеме побега ТФ KNOX активируют экспрессиюгенов биосинтеза цитокининов IPT, представляет интерес изучение роли генов KNOX вразвитии симбиотического клубенька и исследование возможной роли генов KNOX вактивации биосинтеза цитокинина при клубенькообразовании.Целью нашей работы является изучение роли генов KNOX в развитии клубенька улюцерны слабоусеченной (Medicago truncatula) и их возможной роли в активации биосинтезацитокинина.3Задачи работы включают:1.

Анализ экспрессии генов семейства MtKNOX при клубенькообразовании.1.1. Количественный анализ экспрессии генов MtKNOX на разных стадиях развитииклубеньков.1.2. Локальный анализ экспрессии гена MtKNOX3 при клубенькообразовании.2. Анализ экспрессии генов MtIPT и MtLOG, вовлеченных в метаболизм цитокинина, приклубенькообразовании.3. Изучение роли гена MtKNOX3 с помощью изменения уровня экспрессии этого гена втрансгенных корнях.3.1. Изучение влияния сверхэкспрессии гена MtKNOX3 на развитие клубеньков.3.2.

Изучение влияния искусственного подавления экспрессии гена MtKNOX3 с помощьюинтерференции РНК на развитие клубеньков и экспрессию предполагаемых генов–мишеней(MtIPT, MtLOG).4. Изучение непосредственного связывания ТФ MtKNOX3 с промоторамипредполагаемых генов-мишеней (MtIPT, MtLOG).5. Исследование взаимосвязи ТФ MtKNOX с компонентами системы авторегуляцииклубенькообразования (AON) – CLV1-подобной киназой MtSUNN и CLE-пептидами.5.1. Изучение экспрессии генов MtKNOX и MtIPT у суперклубенькообразующего мутантаsunn-3 (в.т.ч.

локальный анализ экспрессии MtKNOX3).5.2. Изучение влияния подавления экспрессии гена MtKNOX3 с помощью интерференцииРНК на экспрессию генов CLE, активируемых при клубенькообразовании.Научная новизна диссертационной работы. Впервые показано участиетранскрипционных факторов KNOX в развитии симбиотических клубеньков у люцерны (M.truncatula). Впервые показана активация экспрессии ряда генов семейства IPT вразвивающихся клубеньках. Впервые показана взаимосвязь между ТФ KNOX3 и активациейцитокининового ответа при развитии клубеньков. Впервые показана активация экспрессиигенов KNOX в побеге в ответ на инокуляцию, что указывает на возможное участие этих геновв AON. Также показано возможное участие ТФ KNOX3 в авторегуляцииклубенькообразования через влияние на экспрессию генов, кодирующих CLE-пептиды. Наоснове полученных данных предполагается общность механизмов активации биосинтезацитокинина в ПАМ, клубеньках и также при авторегуляции клубенькообразования.Методы исследования и достоверность результатов исследования.

В работеиспользованы разнообразные молекулярно-генетические методы (клонирование фрагментовгенов, трансформация бактерий, дрожжей и растений, ПЦР, ПЦР в режиме реального времени,анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA), метод на основе поверхностногоплазмонного резонанса (SPR)), биохимические методы, такие как выделение и очистка белкаиз дрожжей, белковый электрофорез и вестерн-блота, методы микроскопии (визуализацииэкспрессии (GUS-окрашивание), приготовление микропрепаратов), методы культивированиярастений in vitro, компьютерный анализ данных и статистические методы для оценкидостоверности результатов, Исследование проводили с использованием в качествемодельного объекта Medicago truncatula (Jemalong A17).

Достоверность экспериментальныхданных, представленных в диссертации, подтверждена воспроизводимостью результатов внескольких биологических и технических повторностях и доказана с применением методовматематической статистики.Основные положения, выносимые на защиту. 1) Транскрипционные факторыMtKNOX, а именно MtKNOX3/5/9, участвуют в регуляции развития клубеньков у люцерны M.truncatula. 2) Механизм действия транскрипционного фактора MtKNOX3 приклубенькообразовании связан с активацией биосинтеза цитокинина, о чем свидетельствуетизменение экспрессии генов биосинтеза цитокинина в трансгенных корнях с изменениемэкспрессии гена MtKNOX3, а также прямое связывание гомеодомена MtKNOX3 срегуляторными последовательностями генов MtIPT и MtLOG.

3) Транскрипционные факторы4MtKNOX участвуют в авторегуляции клубенькообразования, и их экспрессия в побеге и корнерегулируется с участием киназы MtSUNN.Личный вклад автора. Все исследования, посвящённые анализу экспрессии геновKNOX, IPT, LOG, CLE на разные стадии развития клубеньков, локализация экспрессии генаMtKNOX3 в клубеньках дикого типа и мутанта sunn-3, анализ экспрессии генов KNOX, IPT впобеге и корне при активации системы авторегуляции клубенькообразовании, получениетрансгенных корней с разной экспрессией гена MtKNOX3, а также эксперименты по изучениювзаимодействия фактора MtKNOX3 с регуляторными последовательностями предполагаемыхгенов-мишеней проведены лично автором. Материалы, вошедшие в совместные публикации,обсуждались с соавторами и руководителем работы.Теоретическая и практическая значимость работы. Предложена новая схема,объясняющая участие ТФ KNOX в клубенькообразовании у люцерны и их роли в биосинтезецитокинина.

Результаты работы расширили понимание роли транскрипционных факторовKNOX в развитии растений и, в частности, при клубенькообразовании. Результаты даннойработы могут быть использованы в материалах курсов лекций «Симбиогенетика», «Генетикаразвития растений» и «Актуальные проблемы биотехнологии», читаемых на кафедре генетикии биотехнологии СПбГУ.Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены в видечетырех статей, опубликованных в ведущих журналах, а также в виде устных и стендовыхдокладов на научных конференциях.

Работа выполнялась при поддержке грантов РНФ: 16-1610011, РФФИ: 15-34-271, РФФИ: 14-04-00591Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав и приложений.Полный объём диссертации составляет 168 страницы с 68 рисунками и 3 таблицами. Списоклитературы содержит 235 наименований.Материалы и методыРастительный материал. В работе использовали линию люцерны слабоусеченнойMedicago truncatula Gaertn A17, полученную из сорта Jemalong (семена получены изУниверситета г.