Автореферат (Структура и функции сигнальных белков PII у одноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis), страница 3

reinhardtii, растений и бактерий.Chlamydomonas reinhardtii (Cr; XP_001703658.1), Arabidopsis thaliana (At; NP_192099.1), Oryzasativa Japonica (Os;NP_001054562.1), Solanum lycopersicum (Sl; AAR14689.1), SynechococcusPCC 7942 (Sy; P0A3F4.1), Synechocystis sp. PCC 6803 (Sc; CAA66127.1), E. coli (Ec;AP_003139.1). Выделенные черным остатки консервативны, у 60% охарактеризованных PIIбелков. Блоки I и II обозначают две консервативные последовательности субсемейства GlnB,PS00496 и PS00638. Белыми и черными стрелками обозначены позиции тирозина,подвергающегося уридилированию в PII E. coli, и серина, фосфорилируемого у SynechoccocusPCC 7942, соответственно.

Основания, участвующие в связывании АТФ отмечены чернымикружками, NAGK – черными квадратами, 2-ОГ черными треугольниками. Выравниваниепоследовательностей проводилось с помощью программного обеспечения ClustalW.Для многих бактериальных PII-белков характерна регуляция путемпосттрансляционных модификаций (уридилирования, фосфорилирования,аденилирования). Однако в первичной последовательности CrPII и CvPII, такжекак и в белках некоторых высших растений, уридилируемый у протеобактерийтирозин в положении 51, локализованный в Т-петле, заменен остаткомфенилаланина (рисунок 1).

Кроме того, фосфорилируемый в PII цианобактерийостаток серина в положении 49, у PII-белков C. reinhardtii и С. variabilis замененна остаток треонина в этом сайте, что не исключает возможностифосфорилирования. Однако в нашей лаборатории было показано, что, как игомологи PII растений, CrPII не фосфорилируется. Значительное сходствоаминокислотных последовательностей CrPII и CvPII в этой области позволяетпредположить, что белок CvPII также не подвержен ковалентноймодифицификации путем фосфорилирования.Примечательной особенностью PII-белков зеленых водорослей и наземныхрастений, включая CrPII и CvPII, является наличие у них удлиненных участков наN- и С-концах, которые отсутствуют в PII прокариот.

Проведенный в работеанализ показал, что N-концевые последовательности PII C. reinhardtii и C.variabilis, содержат транзитные пептиды, определяющие хлоропластнуюлокализацию и отрезаемые у зрелых белков.9Анализ регуляции синтеза CrPII и CvPIIРанее была показана регуляция синтеза белка PII A. thaliana на уровнетранскрипции (Uhrig et al., 2009).

Методом ПЦР в режиме реального временинами было установлено, что экспрессия гена CrGLB1 увеличивается в гаметах(рисунок 2A). Известно, что свет необходим для дифференциации вегетативныхклеток Chlamydomonas в компетентные гаметы в условиях недостатка азота всреде (Beck и Acker, 1992). Синий свет через фототропин-зависимый сигнальныйпуть запускает дифференцировку прегамет (незрелых гамет, которые не способнык формированию пары с гаметами противоположного типа спаривания) вфункциональные гаметы (Pan et al., 1997).

Использование мутанта lrg6,демонстрирующего способность к формированию компетентных гамет в темноте(без светового сигнала) (Dame et al., 2002), позволило выяснить, что экспрессияCrGLB1 не связана со световым контролем гаметогенеза (рисунок 2Б). Крометого, после удаления из среды азота также происходило временное увеличениетранскрипции CrGLB1 (рисунок 2В).

Однако методом Вестерн-блоттинга нам неудалось зафиксировать достоверных различий в уровнях белка CrPII (рисунок 2А,Б, В).Рисунок 2. Экспрессия CrGLB1 в (А) вегетативных клетках (□), прегаметах ( ) и гаметах (■)штаммов дикого типа СС-124 и мутанта lrg6; (Б) в вегетативных клетках СС-124 в темноте (■) ипосле освещения белым светом (□); (В) в вегетативных клетках СС-124 в среде без азота.

Нанижних панелях приведена оценка уровней белка CrPII с помощью Вестерн-блоттинга сиспользованием специфичных к PII антител.Нами была определена полная последовательность гена, кодирующего PII уC. variabilis который был обозначен как CvGLB1 (GenBank:KJ524571).10Кодирующая область гена CvGLB1 содержит шесть интронов и семь экзонов.Размер интронов колеблется от 87 до 348 п.о. Сайты сплайсинга экзон/интрон иинтрон/экзон согласуются с консенсусными мотивами G↓GTGAG и (С/А)CAG↓G(инвариантные основания выделены жирным шрифтом).

Кодирующаяпоследовательность ДНК соответствует белку из 210 аминокислот смолекулярной массой 21,96 кДа.По нашим данным транскрипция GLB1-гена, кодирующего белок PII у C.variabilis не зависела от условий культивирования клеток (фазы роста культуры,наличия источников азота в среде). На основании этого, CvGLB1 можетиспользоваться в качестве референс-гена для количественного анализа экспрессиигенов у C. variabilis NC64A.Анализ внутриклеточной локализации и олигомерного состояниябелков CrPII и CvPIIПроведенный анализ последовательностей N-терминальных транзитныхпептидов предполагает хлоропластную локализацию CrPII и CvPII. Дляэкспериментального подтверждения клеточной локализации методом Вестернблоттинга нами были проанализированы белковые экстракты С.

reinhardtii изклеток и предварительно выделенных хлоропластов. В качестве контроляиспользовались антитела к цитоплазматическому белку NAB1, хлоропластному –CGE1 и митохондриальному – AOX1. В экстрактах, полученных из хлоропластов,были зафиксированы только CGE1 и CrPII, причем только его зрелая,процессированная форма.Рассчитанная в работе молекулярная масса непроцессированных форм CrPIIи CvPII, составляет 22,07 кДа и 21,96 кДа, соответственно.

Белкисоответствующего размера были обнаружены при анализе тотальных клеточныхбелков С. reinhardtii и С. variabilis (рисунок 3А). Вычисленная молекулярнаямасса зрелых CrPII и CvPII (без последовательностей транзитных пептидов)составляет 17.54 и 17.1 кДа, соответственно. Вклеточных экстрактахрастворимых белков обоих микроорганизмов были также выявлены вторыеполосы, соответствующие белкам этого размера (рисунок 3А).Консервативная последовательность В-петли [ST]-x(3)-G-[DY]-G-[KR]-[IV][FW]-[LIVM], присутствует не только в PII прокариот, но также в белках этогосемейства у высших растений и одноклеточных зеленых водорослей (рисунок 1).Основания этой последовательности принимают участие во взаимодействиимежду мономерами при формировании тримера.

PII высших растений и бактерийфункционируют как (гомо)тримеры (Mizuno et al., 2007). Для экспериментальногоподтверждения формирования тримерных структур белками CrPII и CvPII, былиполучены и очищены рекомбинантные белки (StrepCrPII-tp и StrepCvPII-tp),которые далее анализировались методом эксклюзионной хроматографии (гельфильтрации). Поскольку размер элюируемых белков составляет около 49 кДа дляCrPII и 53,5 кДа для CvPII (рисунок 3Б), а в денатурирующем SDS-ПААГ порядка 18 кДа, был сделан вывод о формировании этими белками тримеров.11Рисунок 3.

Иммунодетекция (А) и гель-фильтрация (Б) белков CrII и CvPII. Во вставкеприведена стандартная калибровочная кривая по белкам с известными молекулярнымимассами. mAU – уровень сигнала УФ-детектора (280 нм). Ve/Vo – объем элюции (мл).Взаимодействие PII-белков с N-ацетил-L-глутаматкиназамиБелки PII функционируют за счет белок-белковых взаимодействий,контролируя широкий спектр мишеней в клетке, включающих ферменты,транскрипционные факторы и белки-транспортеры. У фотосинтезирующихорганизмов в процессе эволюции появилась уникальная мишень, контролируемаяPII-белками, – ключевой фермент биосинтеза аргинина – N-ацетил-Lглутаматкиназа (NAGK).

Ранее были получены кристаллические структуры PIINAGK S. elongatus (Llacer et al., 2007) и A. thaliana (Mizuno et al., 2007), согласнокоторым три димера NAGK образуют гексамерный тороид, взаимодействующий сдвумя тримерами PII. Методом эксклюзионной хроматографии нами былопоказано, что как и CrNAGK (рисунок 4А, вставка), белок CvNAGK представляетсобой гексамер (рисунок 4А).Кроме того, нами был проанализирован процесс формирования комплексовмежду CvPII и CvNAGK (рисунок 4Б). Было показано, что эффективноеобразование комплексов с четким пиком элюции, соответствующим по размерукомплексу из двух тримеров CvPII и одного гексамера CvNAGK, происходиттолько в присутствии глутамина.

Интересно, что в присутствии 2-ОГ профильэлюции не изменялся и идентифицировался единственный пик с молекулярноймассой близкой к 265 кДа (рисунок 4Б). Таким образом, 2-ОГ не оказываетингибирующего действия на образование комплекса NAGK-PII. Сходное действиеглутамина и 2-ОГ было описано и для комплекса CrPII-CrNAGK (Chellamuthu etal., 2014).12Рисунок 4.

Анализ методом гель-фильтрации (А) олигомерного состояния CvNAGK и CrNAGK(вставка) и (Б) формирования комплекса белков CvPII и CrPII.Действие CrPII и CvPII на активность NAGKКаталитическая активность NAGK оценивалась с использованиемописанного ранее метода сопряженных ферментных реакций (Beez et al., 2009).Были определеныкинетические константы очищенного рекомбинантногофермента CvNAGK, который демонстрировал значения Km для NAG 1,5 ± 0,12mM и максимальное значение Kcat 35,35 ± 1,04 с-1 .

Значение Km оказалосьблизким полученному ранее Km Arabidopsis thaliana AtNAGK (Km (NAG) 0,87 ±0,11 мм), но в 5 раз ниже, чем у NAGK Synechococcus elongatus SeNAGK (Km(NAG) 7.4 мМ). Примечательно, что значение Kcat CvNAGK являетсяпромежуточным между значениями, зафиксированными ранее для AtNAGK (126с-1) и SeNAGK (13 с-1) (Beez et al., 2009).

Значения обоих кинетические параметровдля CrNAGK несколько выше, чем у Chlorella и составляют Km (NAG) 7.7 мМ иKcat 56,76 с-1, что указывает на более высокую скорость протекания реакции, номеньшую чувствительность к субстрату белка Chlamydomonas (Chellamuthu et al.,2014).Ингибирование аргинином активности NAGK представляет собой ключевойрегуляторный механизм, контролирующий биосинтез аргинина.

В связи с этимбыли проведены исследования эффекта ингибирования CvNAGK аргинином.Значение половины максимальной ингибирующей концентрации аргинина (IC50)составило 1,2 ± 0,05 мМ (рисунок 5А), что близко к значению, определенному дляAtNAGK (1 мМ). Однако как было показано, значительно более высокиеконцентрации аргинина были необходимы для ингибирования CvNAGK посравнению с CrNAGK (IC50 0.11 мМ) (Chellamuthu et al., 2014).13Рисунок 5. Анализ ферментативной активности (А) CvNAGK в присутствии и отсутствии CvPIIс глутамином в зависимости от концентрации аргинина; (Б) CvNAGK в присутствии аргининаи CvPII в зависимости от концентрации глутамина; (В) CvNAGK в присутствии аргинина,CvPII, глутамина в зависимости от 2-ОГ; (Г) AtNAGK в присутствии аргинина и белков AtPII,PpPII, OsPII в зависимости от концентрации глутамина.Белок PII ослабляет ингибиторное действие аргинина на NAGKцианобактерий и Arabidopsis thaliana (Beez et al., 2009).